植物学大实验论文砷胁迫对小麦幼苗生长和生理生化特征的影响研究.docx

砷胁迫对小麦幼苗生长和生理生化特征的影响研究何秋萍，何颖，吴洽宇，邹芒阁，顾晓枫，贾习云，赵姝雯摘要：本实验研究砷胁迫对小麦幼苗形态和生理特性的影响。对小麦幼苗用一定浓度的砷处理。每隔4天测量一次株高、叶长、叶宽。12天之后，测量对照组和处理组地上部和地下部的鲜重、干重和含水量，以及测定组织中游离丙二醛（MDA）含量、叶绿素荧光动力学和根活力三项生理指标。并对植株组织进行切片观察。砷胁迫对小麦幼苗的生长发育存在着抑制作用。关键词：小麦，砷胁迫，生理特征，石蜡切片Effects of As(V) Stress on the Growth and Physiological and Biochemical traits of wheat Abstract: This research aimed to study effect of As(V) stress on the Growth and Physiological and Biochemical traits of wheat. Using wheat as material, treated with certain concentration of As(V). We measure its high and length every 4 days. After As(V) Stress 12 days, we measured the fresh weight; dry weight and water content of the over ground part and the underground part. Then we measured the physiological Characteristics such as the content of malondialdehyde (MDA) and the chlorophyll fluorescence kinetics parameters and root activity. Finally we made the paraffin section. The result showed that the growth of wheat was inhibited by As(V) stress.Key words: wheat, As(V) stress, physiological traits, paraffin section.引言重金属是一种重要的环境污染物, 随着工业的发展及污染物的排放， 重金属引起的生态危机和生态后果已引起人们的高度重视1。而砷作为重金属五毒之一，其污染成为世界关注的焦点。砷广泛存在于自然界中，工业废水排放是水体砷污染的主要来源，燃煤和冶炼是大气中砷污染的主要来源2。而且，砷能够长期在土壤、大气和水体中在，威胁到动植物和人的健康。小麦是我国的主要粮食作物，它的种植面积超过作物总种植面积22%。长期使用含有砷的地下水灌溉使得土壤中砷含量严重超标，砷通过土壤迁移、转化和累积在小麦体内并发生毒害作用3。砷污染危害小麦生长表现在小麦生长发育的各个阶段甚至涉及到具体的生理代谢过程，砷超标使我国小麦的出口已受到严重限制。目前研究砷对作物的影响多侧重于作物对砷的吸收和累积4-5。本实验用一定浓度的砷处理小麦幼苗，研究砷胁迫对小麦幼苗生长和生理生化特性的影响。1 材料与方法1.1 材料小麦种子（镇麦6号）1.2 方法1.2.1 小麦种子催芽与幼苗培养选取100颗大小一致，籽粒饱满的小麦种子，放入100ml烧杯中，用1%次氯酸钠浸种消毒20分钟，后用蒸馏水彻底漂洗。置于铺有滤纸的培养皿中，室内浸种24h。小麦萌发后，选取根芽粗壮的种子移入装有石英砂的塑料盆钵中。每盆10到15株，置于温暖处生长。幼苗初露后，每隔1d喷水一次。待幼苗长至一叶一心后换用1/4Hoagland培养液培养。1.2.2 砷胁迫处理 至小麦幼苗长至2叶期后，选择生长状况一致的小麦幼苗30株移入烧杯，六个烧杯（用黑色塑料袋包裹）每杯5株，烧杯的泡沫板上做好标记，以3盆为对照，继续用1/4Hoagland培养液培养，3盆用1/4Hoagland培养液培养并加15mol/L6-7 Na2HASO4处理，分别标记为CK、TK。处理期间继续定期换培养液0，4，8d进行非损坏性生长观察，处理12d时，分别取各盆植株各项生理生化指标进行测定。1.2.3 小麦植株生长观察 于0，4，8，12d砷处理后，每盆标定三株，连续调查株高、叶长、叶宽、叶片数。记录并进行统计分析。测量工具为普通厘米尺，取平均值。株高的测定：每株小麦苗从沙层表面到最长叶片顶端的高度；叶长的测定：最长的叶子从叶鞘基部到叶顶端的长度；叶宽的测定：最宽的叶片中间最宽处的宽度，取平均值，各组数据进行统计分析。1.2.4 组织含水量测定 处理12d时，取上述观察的完整植株，分别称取地上和地下部分样品鲜重（FW），后70烘干至恒重，称量干重（DW），分别计算地上部和地下部的组织含水量（%）=（FW-DW）/DW100%，取平均值，各组数据进行统计分析。1.2.5小麦组织中游离丙二醛（MDA）含量测定 于每盆中分别取全展叶，剪去叶片基部和尖部，每一份样品取0.5g，剪碎置于研钵中，分次加入5%TCA，TCA总量为5ml，研磨成匀浆后，全部倒入5ml离心管中，3000rpm下离心10min。取上清液2ml，加0.67%TBA 2ml，混合后在100水浴上煮沸30min，冷却后再次离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。按公式D532-D600=155000CL 算出MDA浓度（mol/L）；进一步计算出单位重量组织中MDA含量（mol/FW）。式中D532和D600分别表示532nm和600nm波长处的消光度值。L为比色杯密度（cm）。还可以根据相应组织的含水量进一步换算成单位组织干重的MDA浓度（molgFW-1）。各组数据进行统计分析。1.2.6 叶绿素荧光动力学参数的测定 用没有经受认为机械损伤的植株上取全展叶，每盆取三片，减去叶基和叶尖后，用信封包裹，暗处理30min后用PEA测定叶绿素荧光参数。记录F0（初始荧光值）和Fv/Fm（Fm：最大荧光值，Fv：暗适应条件下当所有非光化学过程处于最小时的最大可变荧光，Fv=Fm-F0）。 Fv/Fm：PS的最大光化学量子产量，当植物收到逆境胁迫时，Fv/Fm会显著下降。对数据进行统计分析。1.2.7根活测定取 0.4%TTC溶液0.25ml放入10ml试管中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列，以空白做参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。称取根尖样品0.2-0.3g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml。把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温4.5h，此后加入1mol/l硫酸2ml，以终止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其它操作同上。）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml一起在研钵内磨碎，以提出甲腙。将红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验做参比，测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。1.2.8植物微观形态与结构观察 石蜡切片，是将植物切成薄的材料，按下列主要步骤与要求制成永存切片。分别取处理12d后对照组和处理组的叶的相同部位，按照石蜡切片制作的操作流程处理（取材，固定，抽气，脱水，渗蜡，包埋，修块，切片，烫片，烘片，脱蜡，染色，透明，封片）制成石蜡切片。通过显微镜观察切片结构，并用计算机软件对叶片厚度、维管束长、维管束宽、叶肉细胞大小这四个指标在不同的切片材料上进行测量，记录数据并进行统计学分析。2 结果与分析2.1 砷胁迫对小麦生长的影响2.1.1 砷胁迫下小麦幼苗的形态观察从外部形态来看，对照组相比砷处理组的小麦幼苗健壮，叶色浓绿，植株高。植株生长状况见下图：对照（12天）处理（12天）2.1.2 两种处理下对小麦幼苗株高、叶长、叶宽的影响由图1可以看出，处理前，对照组和处理组植株的平均株高无显著差异，在对处理组施加As处理4天后，可以看出处理组与对照组株高已经开始出现明显差异，对照组平均株高开始高于处理组，表明重金属处理后小麦幼苗的生长速度放缓。随着时间的增长，处理组与对照组间的株高差越来越大，说明重金属As明显抑制小麦生长现象。图1.砷胁迫对小麦幼苗株高的影响结合砷处理对叶长、叶宽影响的两图（图2、3）可以看出，处理前对照组的叶长、叶宽间的差异不明显。从第四天开始，对照组叶长、叶宽均要高于处理组，两者差异显著，表明重金属As使得小麦叶生长速度减缓。到第8天后，处理组与对照组叶长差异极显著，说明随着重金属As处理时间的延长，小麦叶子生长受抑制的现象越来越明显。图2.砷胁迫对小麦幼苗叶长的影响图3. 砷胁迫对小麦幼苗叶宽的影响2.2砷胁迫对植株组织含水量的影响组织含水量是反映植物苗期生理状态的重要指标，能反映植物所受的水分胁迫的程度。As胁迫处理12天后，地上部分含水量低于对照组，但差异不显著；地下部分含水量反而高于对照组，差异也不明显。原因可能在于我们组采取的是水培法，重金属引发的水胁迫对于小麦而言不明显。图4. 砷胁迫对小麦幼苗组织含水量的影响2.3两种处理下对小麦幼苗丙二醛（MDA）含量的影响丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，会严重损伤稀细胞膜系统，MDA与膜上蛋白结合会引起蛋白质分子间和分子内的交联。细胞膜系统受到破坏后，透性增加，MDA反应了膜受损程度。如图 所示，15umol/L As处理后，叶片中的MDA含量增加，这表明重金属胁迫下，小麦幼苗叶片的膜脂过氧化程度增加，小麦幼苗的膜系统受到伤害，膜脂过氧化产物及膜透性对胁迫的响应比较一致，表现为细胞膜透性增大，电解质大量外渗，膜脂过氧化产物累计。图5. 砷胁迫对小麦幼苗叶片丙二醛（MDA）含量的影响2.4砷胁迫下对小麦幼苗叶绿素荧光动力学参数的影响Fo是在暗适应状态下当PSII的所有反应中心处于完全开放状态并且所有的非光化学过程处于最小时的荧光产量。由图6可知，As处理后小麦叶片其初始荧光值较对照高，但差异不显著。表明小麦叶片中的PSII反应中心结构没有改变。Fv/Fm 表示PS II的最大光化学量子产量。从图7看出，15umol/L As处理后叶绿素荧光动力参数总体呈下降趋势，但差异不显著，说明在这个浓度下As胁迫对PSII反应中心光能转化效率没有显著变化。图6. 砷胁迫对小麦幼苗叶绿素初始荧光值Fo的影响图7. 砷胁迫对小麦幼苗叶绿素荧光动力参数Fv/Fm的影响2.5砷胁迫下对小麦幼苗根活力的影响由于在土壤污染物与作物的关系中, 最直接的受害部位是作物的根系8，所以本实验用TTC法测根活力。由图8可以看出：12天处理后，处理组根活显著高于对照组。这有两种可能：浓度为15umol /L的As处理激活了小麦植株一系列应激机制，使根系具有了一定的调节能力，根系活力有所上升；据我们自己的观察记录，处理组经12天As处理后，小麦根系变成了红褐色，而对照组仍然保持无色。根经TTC法处理时，处理组小麦根的红褐色干扰了TTC颜色反应，使处理组的根活高于对照组。如果后续做重复实验时，应该想方设法去掉处理组根的红褐色。图8. 砷胁迫对小麦幼苗根活的影响2.5 植物组织微观形态的差异对所制小麦叶横截面切片进行拍摄观察，测量维管束直径、导管腔直径、叶中脉厚度三项数据。以下为拍摄照片：导管维管束叶肉细胞叶绿体A对照（CK）1040（部分细胞破碎（尤以表皮细胞为最），细胞内的叶绿体被释放出，维管束形状清晰但完整度不高。）维管束导管B.对照（CK）1040（此图为切片中最为完整的维管束结构，虽然染色较深，但形状清晰完整。）维管束导管叶绿体A.处理（TK）1040（材料部分区域出现断裂，细胞破碎严重，染色过浅，但如上图所示的两个维管束保存较为完整、清晰。）导管维管束叶肉细胞B.处理（TK）1040（材料不完整，叶肉细胞破碎，唯有中间的维管束没有破碎。）依据切片制作情况，对照组和处理组各设6 次重复，分别为CK 1 6，TK1 6。以下是测量数据及处理结果：表1. CK的测量数据CK叶片厚度( m)茎维管束直径( m)导管直径( m)叶肉细胞大小( m)1160.6730.116.5729.562211.8042.0913.3136.463167.5331.168.5930.764127.7883.2126.0521.885143.5995.0530.6223.266112.8378.7522.2915.27表2.TK的测量数据TK叶片厚度( m)茎维管束直径( m)导管直径( m)叶肉细胞大小( m)1114.9366.5620.0320.95282.3232.3710.3015.113110.9278.5618.1520.014132.0845.1210.0818.315131.1258.8412.2922.536137.3863.8523.0924.26表3.数据处理叶片厚度(m )维管束直径(m )导管直径(m )叶肉细胞大小(m )Ck均值154.0360.0617.9126.20Tk均值118.1357.5515.6620.20图9. 砷胁迫对小麦幼苗叶片微观形态的影响解剖结构观察：总体看来，处理组植株比对照组植株弱小。砷胁迫组的叶的维管束的直径，导管的直径，叶肉细胞的大小，叶片的厚度都明显小于对照组。可能是砷的毒害导致根系供应水分能力的减弱，从而形成水胁迫抑制小麦的生长。由资料可知：砷的毒害导致根系供应水分能力的减弱，显著抑制了小麦叶片的蒸腾速率。在As60mg/L时，由于小麦受到砷毒害严重，植物体趋于死亡，植物体的生理机能几乎完全丧失，碳酸酐酶等酶系统不能正常工作，使胞间的CO2不能及时合成有机物质，CO2在细胞间累积，光合作用被完全破坏，形成了非气孔限制。73. 讨论在砷胁迫下，由外观形态可得，小麦的株高、叶长、叶宽生长都受到明显抑制。随着砷胁迫时间的增加，处理改变了保护酶活性，在一定程度上削弱了防御系统的清除能力，破坏了正常情况下细胞内自由基的产生与清除的平衡，使自由基大量积累,膜质过氧化产物(MDA) 含量增加。自由基极易攻击类脂中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用。丙二醛（MDA）是脂质过氧化作用的重要产物之一。产生的MDA能够与细胞膜上的蛋白质、酶等结合，引起蛋白质变性失活，从而破坏细胞膜的结构和功能9。脂质过氧化能够使叶绿体的形态和结构变化加剧，叶绿体整个片层系统逐渐膨大，基粒数目减少，类囊体空间增大，使叶绿素降解，光合酶下降，从而降低光合速率，减少生长量。总之，在砷胁迫下，小麦幼苗受到一定程度伤害。参考文献1王宏镔,束文圣,兰崇钰. 重金属污染生态学研究现状与展望J. 生态学报, 2005, 25(3): 596- 604.2Huysmans K D, Frankenberger W T. Arsenic resistant microorganisms isol