谷氨酸发酵培养基.ppt

生物素亚适量法生产谷氨酸 组员 o 李振国 o 芦敏 o 刘祺 o 陆姗姗 o 李雷达 o 董呈呈 o 万东 o 刘玉洋 一、实验目的 o 1、掌握谷氨酸发酵的原理 o 2、掌握谷氨酸种子制备的方法 o 3、掌握谷氨酸发酵过程中的条件控制 o 4、掌握谷氨酸发酵液提取谷氨酸的方法 o 5、掌握谷氨酸纯化的方法 o 6、探究不同糖浓度对菌种生长的影响 二、发酵原理 o1.合成途径 o 谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径) 和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙 酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成-酮戊二酸。-酮戊二酸在 谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生 物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸 发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产 量的谷氨酸。 o在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断 地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜 通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生 菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生 物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需 的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而 抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分 之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构 不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。 发酵原理 o2.发酵过程 o 在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如 下：氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌 种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合 成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。 温度。菌种生长的最适温度为3032 。当菌体生长到稳 定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温 度提高到3437 。pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在 7.08.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物 的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨 ，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。磷酸 盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会 转向缬氨酸发酵。发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提 取。 三、实验试剂与仪器 o 试剂：葡萄糖 、尿素、硫酸镁、磷酸氢 二钾、玉米浆、硫酸亚铁、硫酸锰、水解 糖、玉米浆、K2HPO、MgSO4、尿素、 FeSO4 2ppm、MnSO4、NaS、活性 碳 o 仪器：500ml三角瓶2个、接种环、酒精 灯、摇床、超净工作台、抽滤装置、烧杯 、试管、发酵罐、离子交换柱、PH试纸 或者PH计、1L量筒2个、200ml三角瓶5 个、高压锅 操作步骤 o1一级种子培养工与制：按下列培养基配方配制1000ml一级 种子培养基。按20%装液量分装后，于121灭菌30min冷却 备用。 o葡萄糖 2.5% 尿素0.5% 硫酸镁0.04% o磷酸氢二钾0.1% 玉米浆 2.53.5% o硫酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0 o2一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基 中（250ml三角瓶内接入12环）于321、250r.p.m 条件下培养12h。一级种子质量要求： o种龄 12h pH6.40.1 o光密度：净增O.D值0.5以上 o无菌检查阴性，噬菌体检查无。 四、操作步骤 o3二级种子培养基配制：按下列培养基配方配制1000ml二级 种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121灭 菌30min冷却备用。 o水解糖2.5% 玉米浆2.53.5% K2HPO4 0.15% oMgSO4 0.04 尿素0.4% FeSO4 2ppm oMnSO4 2ppm pH 6.87.0 o4二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按 0.51.0%接入上述已培养好的一级种子，于321、 250r.p.m条件下培养78h，二级种子质量要求： o种龄78h pH 6.87.2 OD值净增0.5左右 o无菌检查（一）、噬菌体无、残糖消耗1%左右 o镜检生长旺盛，排列整齐，G+ 操作步骤 o5发酵培养基配制按下列培养基配方制发酵培养基，并按 20%装液量分装于250ml三角瓶中，水解糖10%，甘蔗糖蜜 0.180.22%，玉米浆0.10.15%，Na2HPO4 0.17%， KCl 0.12%、MgSO4 0.04%，用NaOH（5%）溶液调pH 7.20于110灭菌20min冷却备用。 o6发酵：按810%的接种量在发酵培养基中接入合格的二级 种子注，于351、250 r.p.m条件下发酵35h，发酵过 程中从第4h后开始用无菌注射器补入尿素，尿素流加按pH 值进行控制即8h前pH 7.07.6；8h后pH7.27.3， 2024hpH 7.07.1，2435h，pH6.56.6。尿素流加总 量为4%。从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的 水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。 o7镜检及谷氨酸测定：在8h及24h时分别各取样一次进行镜 检，经单染后观察菌体形态，发酵结束后，用华勃氏呼吸器测 定发酵液中谷氨酸含量。 操作步骤 o 8、谷氨酸的离子交换层析 在溶液的pH小于3.22时，谷氨酸分子带 正电荷，可以用阳离子交换树脂进行层析 分离。由于在此条件下，阳离子交换树脂 对谷氨酸的吸附力较弱，所以应采用强酸 性阳离子交换树脂，若采用弱酸性阳离子 交换树脂，则吸附性较差，容易脱落； 酸使稀硫酸 操作步骤 o 谷氨酸钠的生产 o 纯化谷氨酸中和脱色浓缩结晶分 离 味精发酵生产工艺流程 一 、谷氨酸的中和 o 谷氨酸的中和是指谷氨酸与碱或碱性盐反应生成 谷氨酸钠的过程。 o 中和作用所使用的碱是氢氧化钠，使用的碱性盐 为碳酸氢钠或碳酸钠。 o 在谷氨酸钠的生产过程中，控制中和液的pH在6.4 6.7的范围，就可使谷氨酸大部分生成谷氨酸钠 。pH过低，则中和不完全；pH过高，则生成较多 谷氨酸二钠，都会使谷氨酸钠生成率降低。 o 温度一般控制在60左右。 二 、除铁 o 在谷氨酸加碱中和后，中和液还需要进行除铁过 程，即通过一些处理，以除去存在于中和液中过 量的铁离子。 o 由于铁离子容易氧化变成黄色，对谷氨酸钠的质 量有所影响。所以谷氨酸钠产品必须控制铁离子 的含量，一般要求低于5mgkg。 (1)硫化钠除铁 o 硫化钠除铁是在谷氨酸中和液中加入一定量10% 左右浓度硫化钠溶液，生成硫化亚铁沉淀。 o Fe2+ + Na2S FeS + 2Na+ o 由于硫化亚铁在碱性条件下几乎不溶于水，而在 酸性条件下溶解度较大，所以在操作时为了除铁 较完全，应控制好pH，并加入稍过量的硫化钠。 (2)离子交换树脂除铁 o 谷氨酸中和液中的铁，一般以二价或三价铁 离子存在。可以采用适当的离子交换树脂进 行离子交换而除去。 o 我国常用于谷氨酸中和液除铁的离子交换树 脂有通用一号树脂、122弱酸性阳离子交换 树脂和酚醛树脂等。 o 采用离子交换树脂除铁，除铁较完全，而且 不会有残留的硫化钠存在于谷氨酸钠产品之 中，在实际生产中较多采用。 三、脱色 o (1)活性炭脱色 o 采用颗粒状的活性炭进行脱色时，一般是让谷氨 酸钠溶液通过活性炭柱，色素被吸附，而得到的 流出液为脱除了色素的谷氨酸钠溶液。 o 采用粉末状活性炭进行谷氨酸钠溶液的脱色时， 一般是将粉末状的活性炭按溶液体积的1%2%的 比例加到谷氨酸中和液中，不断搅拌2h左右，使 活性炭充分吸附色素，然后通过过滤除去，以达 到脱色目的。 (2)离子交换树脂脱色 o 由于谷氨酸钠溶液中所带的色素大部分是与蛋 白质结合的大分子物质，一般带负电荷，所以 ，选用的脱色树脂一般都是大孔径的阴离子交 换脱色树脂。 o 脱色是在谷氨酸中和、除铁以后进行，中和液 的pH为6.46.7。脱色温度以4050为宜。 四、 浓缩与结晶 经过上述中和、除铁、脱色处理以后，得到 较纯的谷氨酸钠溶液。该溶液含有大量的水 ，需要经过浓缩与结晶，才能得到所需的谷 氨酸钠结晶产品。 o 1、浓缩 o 在6570条件下进行蒸发浓缩，当溶液 浓度达到3030.5波美度时，即可加入谷氨 酸钠晶种进行结晶。 o 2、结晶 自然起晶、刺激起晶、晶种起晶 o 加入的晶种颗粒的大小一般为2440目，加 入量一般为谷氨酸钠含量的10%15%。加入 晶种后，慢慢搅拌。 o 五、干燥 o 真空干燥、气流干燥、红外线干燥、冷冻干 燥、吸附干燥、喷雾干燥等。在谷氨酸钠结 晶的干燥方面，常用的有真空干燥和气流干 燥等。 味精发酵设备（参考） 说明： oppm是英文parts permillion的缩写，译意是每百万分中的一 部分，即表示百万分之（几），或称百万分率。如1ppm即一 百万千克的溶液中含有1千克溶质。ppm与百分率（）所表 示的内容一样，只是它的比例数比百分率大而已。 o在花卉生产栽培中，常常施用“微肥