血红蛋白的提取和分离(人教版.ppt

,琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。,【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是 A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D.以上说法都正确 【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点： (1)凝胶色谱法的原理； (2)电泳法的原理。,【标准解答】选A。凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法；电泳法是利用待测样品中各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离或鉴定。所以A正确，B错；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。综上所述，答案选A。,【互动探究】(1)相对分子质量不同的蛋白质在凝胶色谱中的运动情况如何？ 提示：分子很小，可进入凝胶全部的内孔隙；分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙。 (2)为消除净电荷对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入SDS的原因是什么？ 提示：SDS所带负电荷的量远远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。,【变式训练】(2010宿州高二检测)利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是( ) A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子质量小的 D.所带电荷多的 【解析】选A。凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。,2.凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的装填：用蒸馏水溶胀凝胶均匀装填色谱柱在约50 cm高的操作压下，用300 mL的物质的量浓度为 20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。 (2)打开流出口，使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口,(3)样品的加入和洗脱 用吸管将1 mL透析后的样品加到色谱柱顶端，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内后，关闭下端出口。 小心加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0)到适当高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。 色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,【典例2】(2011扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：,(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。 (2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。 (3)甲装置用于_ ，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_ _分离蛋白质的有效方法。 (4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,【解题关键】(1)理解凝胶色谱法的原理；(2)分析磷酸缓冲液的作用；(3)掌握蛋白质的分离与提取方法。 【标准解答】(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是磷酸缓冲液；乙装置中，C溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装置用于透析(粗分离)，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。用乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,答案：(1)运输 (2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小