益生菌的筛选--毕业论.doc

福州大学至诚学院本科生毕业设计（论文）题 目： 益生菌的筛选 姓 名： 江福萍 学 号： 211110111 系 别： 生物工程 专 业： 生物工程 年 级： 2011级 指导教师： 2015 年 05 月 25 日独创性声明本毕业设计（论文）是我个人在导师指导下完成的。文中引用他人研究成果的部分已在标注中说明；其他同志对本设计（论文）的启发和贡献均已在谢辞中体现；其它内容及成果为本人独立完成。特此声明。论文作者签名： 日期： 关于论文使用授权的说明本人完全了解福州大学至诚学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学院有权保留送交论文的印刷本、复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅；学院可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印、数字化或其他复制手段保存论文。保密的论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 益生菌的筛选中文摘要益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。它是定植于人体肠道、生殖系统内，能改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。动物体内的益生菌主要有：乳酸菌、酵母菌、部分霉菌等。目前，国内外对各类微生物组成的复合活性益生菌产品比较多研究，其广泛应用于生物工程、食品安全、工农业以及生命健康领域。本论文从酸奶、酒、酒曲和自制酵素样品中筛选出益生菌，以蛋白酶活力为指标，筛出酶活高的菌株，并对其在酵素中的应用进行初步探究。研究结果如下：（1）以酸奶、酒、酒曲和自制酵素为样品筛选益生菌，把样品稀释分别涂布于MRS、PDA和孟加拉红培养基上富集、分离，初步筛得42株菌，并编号保藏。将菌株再次分离纯化，结合菌落观察和菌体显微镜观察，复筛出了18类形态特征各不相同的菌株，其中有2类乳酸菌，11类酵母菌，5类霉菌。（2）将初筛得到的42株菌进行蛋白酶活力的测定，得乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株分别是L4、Y14和M14，酶活为319.769U/mL、237.519U/mL和205.363U/mL。并将L4进行分子生物学和生理生化鉴定为嗜热链球菌种。（3）将L4、Y14参考徐祖炎的专利制作成酵素，20天后测得实验组的蛋白酶活力为316.269U/mL，对照组的蛋白酶活力为167.300U/mL。初步说明L4、L14可以提高酵素中的蛋白酶活力这一指标，对酵素的发酵有一定的促作进用，可以提高酵素的功能性。关键词：益生菌，筛选，乳酸菌，酵母菌，霉菌，鉴定，酵素Screening of probioticsAbstractProbiotics is a kind of beneficial microorganisms to its host. It is the generic terms of beneficial microorganism that can produce accurate health benefits, keep microecological balance for its host, as well as other powerful functions in human intestine and reproductive system. There are several beneficial bacterias and fungis in animals: lactic acid bacteria, yeast and some moulds, etc. The most powerful products that we are studying in the world are mainly all kinds of active probiotics composed of microbials that we have mentioned above, which are widely used in biological engineering, industrial area, agricultural area, food safety and health life areas. In this essay, the enzyme of probiotics is purificated from yogurt, wine and homemade enzyme samples. With the protease activities as an index, enzymes of high quality is selected, and is applicated in enzyme preliminary exploration then. The following are the research results:（1）The yogurt, wine, distillers yeast and homemade enzyme are took as the sample, then the sample dilution are coated on the red culture medium MRS, PDA and Bangladesh to enrich and be separated, preliminary we got 42 screening isolates, and they are numbered and preserved. After that, strain is purified again and observed with microscope. 18 kinds of morphological characteristics of different strains are screened out after a second screening. There are two kinds of lactic acid bacteria, 11 kind of yeast and five types of mold in total.（2）42 strains of bacteria got in the early screening are put in the protease activity test of lactic acid bacteria. The highest enzyme activity of lactic acid bacteria, yeast and the mold of strains respectively are L4, Y14 and M14. And protease activity respectively are 319.769 U/mL and 237.519 U/mL and 205.363 U/mL. And L4 is identified as Streptococcus thermophilus according to the molecular biological and physiological and biochemical identification.（3）With the reference to Xu Zuyans patent, L4 and Y14 are made into enzyme. After 20 days, the protease activity of the experimental group are measured to be 316.269 U/mL and protease activity to be 167.300 U/mL in the control group. Preliminary it shows that L4 and L14 can improve the index of protease activity of enzyme, promote the enzyme fermentation as well as improve the functionality of the enzyme.Key words: Probiotics, Screening, Lactic acid bacteria, Yeast, Mold, Appraisal, Enzyme目 录第1章 绪论11.1 益生菌概述11.1.1 益生菌理论的产生11.1.2 益生菌的定义11.1.3 益生菌作用基本机理概述11.1.4 益生菌的来源21.1.5 益生菌的特征21.1.6 益生菌的种类21.1.7 益生菌的作用31.2 益生菌的应用41.2.1 益生菌食品41.2.2 益生菌保健品51.3 益生菌存在的问题51.4 酵素61.4.1 酵素的定义、作用及应用61.4.2 评价微生物酵素的指标61.5 本课题主要研究的内容和意义61.5.1研究内容61.5.2 本课题研究的意义7第2章 实验材料与方法82.1 材料与主要设备82.1.1 实验材料82.1.2 培养基82.1.3 主要试剂82.1.4 主要仪器设备92.2 实验方法102.2.1 菌株筛选102.2.2菌株蛋白酶活力的测定112.2.3 菌株鉴定112.3 菌株作用于酵素中的初探14第3章 实验结果与讨论153.1 益生菌菌株的筛选153.1.1 初筛153.1.2 复筛153.2 菌株蛋白酶活力的测定163.2.1赖氨酸标准曲线的制作163.2.2 菌株蛋白酶活力的测定163.3 菌株鉴定173.3.1 菌落形态及菌体形态观察173.3.2 L4菌株分子生物学鉴定253.3.3 L4系统发育树的构建263.3.4 L4的生理生化实验263.4 L4和Y5菌株应用于酵素的初步探究27结论与展望28结论28展望28参考文献29谢辞33附录1磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液配制表34附录2 L4基因序列3535益生菌的筛选第1章 绪论1.1 益生菌概述 益生菌与人类的健康有着密切的关系，是人体的生态调节剂1，可以维持肠道的菌落平衡和抑制病原菌的生长2。其有着重要的理论定义和广泛的生理作用，目前有许多关于益生菌的报道3-4。1.1.1 益生菌理论的产生人体含有大量的微生物，定居于人体的各个部位5。微生物与宿主之间有着密切的关系。微生物对无菌动物的感染比较敏感6，因为其免疫系统低下和缺乏“竞争性定植”。普通动物与无菌动物之间存在着许多差异，这使人们认识到微生物对人体的健康有着重要的意义7。人体内共生的微生物对宿主的影响利弊共存。利是微生物的某些代谢产物可为人体提供一定能量，可以促进矿物质的吸收和代谢途径；人体内的微生物可以抵制病原体，防止疾病6-8。弊是有些微生物可能与宿主之间构成病原关系，引起宿主的疾病、衰老或死亡。微生物的某些代谢产物可具有致癌的活性，积累过多可能导致癌症7；体内微生物菌相平衡遭到破坏时，会使某些有害菌转为优势菌，引起自体感染9-10。正是出于对人体微生物作用的认识和要对微生物区系趋利避害的想法，促使了益生菌理论的产生11。1.1.2 益生菌的定义益生菌(probiotics)，也有译为“益生素、原生菌”等，是for life对生命有益。1965年被Lilley和Stillwell阐述为“由一种微生物分泌的刺激其他微生物生长的物质或组织提取物”。后来Fuller 15、Guarner12等人也提出了差不多的定义。国际营养学界普遍认可益生菌是一种对人体有益的菌，它们可直接作为食品添加剂服用，从而维持肠道菌丛的平衡13。随着对益生菌研究的深入，益生菌的含义日趋完善，其定义也屡次被修订，益生菌数量及保健功效方面也都得到进一步丰实14。1.1.3 益生菌作用基本机理概述 益生菌被摄入宿主肠道后，在复杂的微生态环境中与近400种正常菌群汇合，改变生物体内的微生物群落，促进宿主的健康。但益生菌的作用机理在理论上还不够成熟，目前主要有3种学说:优势种群学说;菌群屏障学说;微生物夺氧学说。1.1.4 益生菌的来源益生菌的来源相当广泛，新鲜的果蔬中、人体粪便、母乳、发酵乳制品、传统发酵植物食品等都存在益生菌。但其主要来源是动物肠道正常生理性菌和非肠道菌。许多研究人员认为，益生菌来源与其特殊的商业化应用有着非常密切的关系；但FAO/WHO专家建议，益生菌特定的生理作用比其来源更加重要。因为婴儿出生时肠道实际上是无菌的，人体肠道菌群的来源具有很大的不确定性。到现在为止，市场上还未出现基因工程改造的益生菌。1.1.5 益生菌的特征益生菌有一些共同的特征，并非所有益生菌都必须具备所有特点，但其应尽量多地满足以下特征，为益生菌鉴定环节提供很好的标准15-18。其特征如下：源于宿主并对宿主健康有一定的促进作用；能抵抗人体内各种酶及胆汁的消化作用，能正常生活于胃肠道中；能抑制肠内病原体活性；通过产生细菌素或抗菌的代谢产物等，选择性的调节微生物区系的组成；是公认安全的微生物；准确识别菌及其特性，有己被证明的安全性；其制品按合理剂量服用时能具有临床有效性；能是益生菌产品保持活性和稳定性，同时能用于大量生产并具有经济价值。1.1.6 益生菌的种类目前已确认适用于生产的益生菌菌种较少，研究最多的是乳酸菌13。大体上益生菌可分为乳酸菌、酵母菌和霉菌3大类。已经发现的益生菌分别是双歧杆菌类：长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等，乳酸杆菌类：短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，链球菌类：嗜热链球菌属等。此外，还有一些酵母菌，如酿酒酵母菌、布氏酵母菌等，部分霉菌和非致病性大肠杆菌也可以是益生菌19。1.1.6.1 乳酸菌乳酸菌（Lactic acid bacteria），是一类通过发酵糖类获得能量，从而产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，包括乳杆菌和乳链菌20。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、腌渍食品等。我国发酵剂中使用的乳酸菌有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌等，在生产中最常用的是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种纯培养发酵剂21-22。1.1.6.2 酵母菌酵母菌是一种细胞形状呈圆形、卵圆形、椭圆形或柱形，无性繁殖的单细胞真菌。主要有酿酒酵母及产脂酵母，酵母菌在酒精发酵阶段有着重要角色，为后续的醋化阶段提供底物乙醇，但是进入酿醋发酵阶段后，数量则急剧减少，发酵结束后，几乎完全消失。优良酵母菌的特性为23：发酵前期繁殖速度快、发酵产酒精能力强、有一定的后繁殖能力、能产生较好较多的香味物质、生理耐性好等 24。分离鉴定酵母菌，可以为研究酵母菌在酵素等产品发酵过程中的生物特性的研究提供了一定的基础25。1.1.6.3 霉菌霉菌是丝状真菌的通称。其菌落一般较大，菌丝呈长管、分枝状，无横隔壁，具多个细胞核，并会聚成菌丝体。霉菌通常用孢子的颜色来称呼，如黑霉菌或红霉菌。在许多产品生产过程中，霉菌起着非常重要的作用。霉菌能产生许多酶类，在酒类酿造过程中起糖化作用26-28。1.1.7 益生菌的作用1.1.7.1 预防或缓解腹泻据报道，饮食习惯不良或服用抗生素会引起肠道菌群失衡，从而导致腹泻等症状。若经常服用含益生菌的保健食品，有助于恢复正常的肠道pH值和肠道菌群的平衡，可预防或缓解腹泻症状29。1.1.7.2 促进肠道消化系统健康许多益生菌可在胃肠道内产生消化酶，这些酶可使人体更好地消化食物及其营养成分。益生菌可以抑制有害菌在肠道内的繁殖和进入血液循环系统，减少毒素，促进肠道蠕动，从而提高肠道机能，改善排便状况。如嗜酸乳杆菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，从而缓解乳糖不耐症。1.1.7.3 增强人体免疫功能肠道内存在非常发达的免疫系统，但人体的免疫功能会随着年龄的增长而降低。研究表明，益生菌可以通过刺激肠道内的免疫机能，将过低或过高的免疫活性调节到正常状态30。益生菌的免疫调节作用有助于抗癌与抑制过敏性疾病。益生菌对细胞免疫调节作用、体液免疫调节作用和非特异性免疫调节作用都有一定的影响。如双歧杆菌在动物体内能够刺激B 淋巴细胞活化、增殖和分泌抗体，来发挥体液免疫功能 31。科学研究表明，益生菌对宿主细胞免疫系统具有正面作用如增强抵抗力。1.1.7.4 降低血脂胆固醇32益生茵可吸附食物中的胆固醇，促使其排出体外33。益生菌还能吸附肠内的胆汁酸，增强胆固醇转化成胆汁酸，从而减轻血清中胆固醇的含量34。Kawase等研究证实，乳酸菌属和链球菌属的发酵产物能降低血液中总胆固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。Kanagawa等从啤酒酵母和瑞士乳酸杆菌发酵乳中分离的三肽物质具有抑制血管紧张素转移酶活性的作用35。大量科学研究证实酸牛奶中富含益生菌，可降低胆固醇水平，长期补充益生菌还可预防骨质疏松。已申报具有降低血脂脂胆固醇功能的专利菌株非常多，如：L.ucidophilus RP32等36。研究表明，益生菌降低血脂胆固醇水平的作用机制可能包括胆盐的脱结合、胆固醇掺入细胞膜、益生菌对胆固醇的吸收、菌体对胆固醇的吸附、菌体对胆固醇的转化等。1.1.7.5 预防阴道感染酸牛奶中的嗜酸乳杆菌可抑制阴道内白色念珠菌的繁殖。在欧洲所做的双盲对照试验证实了益生菌有预防阴道感染的作用。1.1.7.6 产生重要的营养物质益生菌能产生维生素、短链脂肪酸、氨基酸等，对骨骼成长和心脏健康起重要作用。益生菌可分解脂肪、蛋自质和糖，有利于消化吸收37。李新红38等在健康成体獐的基础口粮中添加了复合酶和益生菌制剂进行消化代谢试验，发现添加复合酶和益生菌后，能够显著提高獐对粮食中粗蛋自、粗纤维和矿物质等营养物质的利用率。1.2 益生菌的应用双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌等益生菌是目前应用最广的。益生菌的功效越来越受关注,已在食品工业特别是发酵乳品工业中得到了广泛的应用39。益生菌理论的研究己在国内外进入高潮的同时，益生菌的应用也已形成了强大的产业。目前国内外益生菌的应用主要有以下几方面。1.2.1 益生菌食品益生菌食品指含有存活且有益于人体健康益生菌的食品。益生菌较多应用于发酵乳制品。另外在一些面包、饼干等食品中也有添加。1.2.1.1 益生菌酸奶益生菌酸奶是以益生菌为主要菌种所生产的发酵乳。它可缓冲胃液和胆汁的pH，服用其制成的片剂或胶囊，益生菌更容易通过人体消化道，促进健康作用。1.2.1.2 益生菌乳制品益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌的食品。应用于奶粉制品比较多，如欧美国家在发酵乳饮料和液态奶中添加乳杆菌和双歧杆菌。有研究表明向干酪中添加粪肠球菌，有保健作用的同时，还可改善其品质40。1.2.1.3 益生菌谷物制品益生菌在80年代中期前后应用于谷物制品，由于其生产较复杂，所以品种不多。美国威斯康星大学的学生为M&M公司开发了一种松脆曲奇，里面加有长双岐杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌的 41。1.2.2 益生菌保健品保健品是用益生菌配合其他物质制成的，主要包括益生菌保健食品和益生菌药品。我国益生菌制品主要以药品形式被大家接受。微生态调节剂可用于健康人，增进健康素质，提高健康水平，同时也会产生治疗与防病的目的。我国现有益生菌制剂有妈咪爱、促菌生、金双岐、益菌生、乳康生等品牌。1.3 益生菌存在的问题益生菌的作用已被人们接受，其在发酵食品或食品添加剂有许多的应用，但也存在许多有待解决的问题，如:目前已经确认的适宜的益生菌菌种不多，仅有乳酸杆菌、链球菌、芽抱杆菌、双歧杆菌及酵母等种属；一些产品中的益生菌在加工、运输过程中易失活；有些活菌难以经受低PH值的胃酸、胆汁酸及胰液等的作用，数量少，难以发挥作用；关于益生菌在体内的作用机理的还不明确，许多学说相互矛盾。1.4 酵素1.4.1 酵素的定义、作用及应用酵素(enzyme)又称为酶，是产生于生物体中具有催化作用的活性大分子42。酵素可催化生物体内几乎所有的生理生化反应。人体的能量摄取、新陈代谢、成长和繁殖等生命现象，都必须通过酵素的帮助才能完成。体内酵素含量和活性的高低，影响着人体的病变和衰老。随着年龄的增大，人体内的酵素数量与活力呈下降趋势。患病者体内的酵素代谢往往是紊乱的，应适当补充特定种类的酵素，可使人体恢复健康且维持良好的状态。因此，现在酵素已被广泛应用于食品和保健品当中。此外，酵素具有分解老化细胞、清洁皮肤、淡化皱纹、消除青春痘、彻底改善肌肤状况等美容功效，还有去除油脂等减肥作用。因此，酵素已经开始应用于化妆品行业。1.4.2 评价微生物酵素的指标微生物酵素含有丰富的酶、维生素、矿物质和次生代谢产物等。微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。蛋白酶能催化蛋白质水解，在人体中的主要作用是分解食物中蛋白质和死亡的细胞，促进营养物质的吸收，有美容效果。脂肪酶是一类水解油脂的酶，起分解油脂的作用，有减肥、保健效果。超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶，可以清除机体内超氧阴离子，可防衰老、抗辐射、抗炎和防治肿瘤等。因此，评价微生物酵素的指标主要是以上3种酶的含量和活力。除此之外还有总酚含量、还原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等都可以作为指标，可以系统的考察微生物酵素的抗氧化活力43。1.5 本课题主要研究的内容和意义1.5.1研究内容(1)初筛：把酸奶、酒、酒曲和自制酵素44样品稀释后分别涂布于MRS、PDA、孟加拉红培养基上倒置培养，富集、分离出乳酸菌、酵母菌和霉菌，并编号保藏。(2)复筛：对初筛得到的菌株进一步分离纯化。(3)菌种鉴定：菌株形态学观察、分子生物学鉴定、生理生化鉴定。(4)应用初探：测定初筛菌株的蛋白酶活力，得酶活高的乳酸菌和酵母菌，参考徐祖炎45的专利制成酵素，探究其蛋白酶活力的变化。1.5.2 本课题研究的意义（1）研究结果有助于进一步了解酸奶、酒、酒曲、自制酵素中微生物的种类；（2）对改良酵素生产工艺及设备，提高产品产量与功能性及技术创新有重要的参考价值；（3）筛选的菌株是实验室科研工作上宝贵的资源，为进一步研究提供菌种。第2章 实验材料与方法2.1 材料与主要设备2.1.1 实验材料（1）蒙牛酸奶；（2）福建省三明市尤溪县的酒和酒曲；（3）自制酵素44：红糖：水果：蒸馏水=1：3：10，自然发酵60-90天，得棕黄色上清即为果蔬酵素。2.1.2 培养基（1）MRS培养基：10g 蛋白胨，10g 牛肉浸膏，5g 酵母浸膏，20g 葡萄糖，5g 醋酸钠，1mL 吐温-80，2g 柠檬酸氢二胺，2g MgSO47H2O，0.05g MnSO44H2O，2g K2HPO4，蒸馏水 1000mL，琼脂 20g，2% CaCO3，pH 6.2-6.6。121高压蒸汽灭菌20 min。（2）PDA培养基：马铃薯 200g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 20 g。121高压蒸汽灭菌20 min。（3）孟加拉红培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，磷酸二氢钾 1g，MgSO47H2O 0.50g，琼脂 20g，1/3000孟加拉红溶液 100mL，蒸馏水 1000mL，氯霉素 0.10g。121高压蒸汽灭菌20 min。（4）LB培养基：胰蛋白胨 1.00%，NaCl 1.00%，酵母提取物 0.50%，蒸馏水定容，PH调至7.2-7.4，121蒸汽灭菌20min。（5）糖发酵基础培养基：麦芽粉：温热水（60-65）=1:4，60保温糖化3小时，碘液检查后4层纱布过滤，加入鸡蛋白和水各20mL，调匀、搅拌煮沸后再用4层纱布过滤，滤液灭菌备用以上不加琼脂即为液体培养基，否则为固体培养基。2.1.3 主要试剂（1）草酸铵结晶紫染液 溶液A:结晶紫 2g；95%酒精 20mL。 溶液B：草酸铵 0.80g；蒸馏水 80mL。 A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。（2）卢戈氏碘液：碘 1.00g，碘化钾 2.00g，蒸馏水 300mL。将碘化钾溶于少量蒸馏水中后，加入碘使其完全溶解，最后加蒸馏水滴定至300mL。配成后贮于棕色瓶内备用。（3）吕氏碱性美蓝染色液:A 液：美蓝 0.30g； 95%乙醇 30mL。B 液：0.0l% KOH l00mL。A、B溶液混合，可稀释使用。（4）乳酸石灰酸棉蓝染色液：石炭酸(结晶酚) 20g，乳酸 20mL，甘油 40mL，棉蓝 0.05g，蒸馏水 20mL。先将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热溶解，冷却备用。（5）无水乙醇、蒸馏水（6）DNA抽提收试剂盒（细菌）、DNA胶回收试剂盒、PCR2MIX、Solution、PMD-18-T：生工生物工程（上海）股份有限公司。（7）磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液： 配法见附录1。（8）100g/mL赖氨酸标准溶液：称取于105干燥冷却后的赖氨酸0.1000g，用1moL/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL赖氨酸标准液。吸取1mg/mL赖氨酸标准液10mL，用0.1mol/L盐酸稀释定容至100ml，即为100g/mL的赖氨酸标准液。（9）1%茚三酮溶液：茚三酮1g，加无水乙醇溶解，定容至100mL。（10）10g/L酪蛋白溶液：酪素1.000g，精确至0.001，少量0.50moL/LNaOH润湿后，加入磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液80mL，在沸水中边加热边搅拌溶解，冷却定容到100mL，4保存。2.1.4 主要仪器设备本课题实验过程中用到的主要仪器和设备见表2-1：表2-1 主要仪器和设备说明表仪器名称仪器型号生产厂家洁净工作台SW-CJ-2FD型上海博迅实业有限公司医疗设备厂生化培养箱LRH-190型广东省医疗器械厂电子天平ISO 9001型赛多利斯科学仪器（北京）有限公司恒温磁力加热搅拌器85-2型上海江星仪器有限公司pH计UB-7型DENVER INSTRUMENT公司移液枪20200 L，1001000 LDREGON LAB电磁炉C20-SH 2050型美的股份有限公司微波炉MM823ESJ-PA型美的股份有限公司 续表2-1仪器名称仪器型号生产厂家数显恒温水浴锅HH-4型国华电器有限公司立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS型上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热鼓风干燥箱DHG-9070A型上海一恒科学仪器有限公司双目生物显微镜ECLIPSE E100型日本尼康株式会社快速混匀器SK-1型国华电器有限公司紫外可见分光光度计UV-1600型上海美普达仪器有限责任公司高速冷冻离心机CF16RX型日本HITACHI公司振荡培养箱QTY-70F型上海知楚仪器有限公司台式高速离心机TGL-16M型湖南湘仪实验室仪器开发有限公司电泳仪电源DYY-6C型北京市六一仪器厂琼脂糖水平电泳槽DYCP-31BN北京市六一仪器厂切胶机OSE-470型北京市六一仪器厂PCR扩增仪T5A/250V型eppendorf超纯水机 WP-UP-LH-20型 四川沃特尔水处理设备有限公司2.2 实验方法2.2.1 菌株筛选2.2.1.1菌株的初筛（1）将酸奶、酒、酒曲和自制酵素44样品按10-110-6梯度稀释后分别涂布于MRS、PDA、孟加拉红培养基上倒置培养，富集、分离纯化出菌株。（2）将所筛菌株编号保藏。挑取1环菌株于相关的液体培养基中摇床培养1天后，按菌液：40%甘油=1:1的比例分装于灭菌冷冻管中，先放在4冰箱放置1天，后放于-20长期保藏。2.2.1.2益生菌的复筛（1）用划线法对初筛的菌株进一步分离纯化；乳酸菌划线于MRS培养基，37恒温封口倒置培养2天；霉菌、酵母菌划线于PDA培养基28恒温倒置培养4天。2.2.2菌株蛋白酶活力的测定2.2.2.1 赖氨酸标准曲线的制作表2-2 赖氨酸标准曲线制作表试剂试管号012345100g/mL标准氨基酸溶液（mL）0.000.200.400.600.801.00蒸馏水（mL）1.000.800.600.400.200.001%茚三酮溶液（mL）0.50570nm吸光值00.1250.4500.5940.7940.9842.2.2.2蛋白酶活力的测定测定方法（吸光光度法）试管A（空白，平行2份）加蒸馏水1ml（80水浴10min）加酪蛋白1ml（40水浴10min）加1%茚三酮1ml（沸水浴，15min）于570nm测定Abs试管B（酶试样，平行2份）酶液1ml+酪蛋白1ml（40水浴10min；80水浴10min）加1%茚三酮1ml（沸水浴，15min）于570nm测定Abs计算公式：根据标准曲线和测得的y值求出赖氨酸含量x值。酶活力(U/g或UmL)=xvn/(tm)式中：x为反应液中的氨基酸含量；v为反应试剂的总体积，3 mL；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间，10 min；m为酶质量或酶体积，g或mL。2.2.3 菌株鉴定2.2.2.1 菌株形态学观察（1）菌落形态观察：将复筛后的菌株在对应的平板上分区划线，以获得单菌落，便于观察其菌落形态；（2）菌体显微形态观察：乳酸菌：革兰氏染色法；酵母菌：美蓝染液水浸片法；霉菌：直接制片观察法。2.2.2.2 菌株分子生物学鉴定基因组DNA提取电泳验证PCR电泳割胶回收T载体连接、制备感受态转化菌液PCR电泳验证测序序列分析（1）细菌DNA提取：采用试剂盒法，按照试剂盒的步骤提取。（2）DNA基因的PCR扩增16S rDNA PCR扩增。通用引物序列如下：正向引物27F： 5-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3反向引物1492R：5- TACggYTACgTTACgACTT-3按表2-3所示的体系添加试剂混匀并排气泡；运行PCR，其反应程序为：Step 1 95预变性5 min；Step 2 95变性30 s；Step 3 55退火30s；Step 4 72延伸90 s；Step 5 重复Step 2至Step 4，循环运行30次；Step 6 72延伸7min；Step 7 4保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产额进行电泳、验证；用DNA胶回收试剂盒回收16SrDNA；表2-3 PCR反应体系组成试剂体积（L）模板1正向引物1反向引物12MIX10ddH2O7（3）T载体连接按表2-4体系16酶连45h：表2-4 T载体连接体系组成试剂体积（L）模板5Solution5PMD-18-T0.50（4）感受态制备取菌种DH5接种于LB试管（5ML/管），37、200rpm过夜培养；LB过夜培养试管中的菌液平均分到两支新LB试管中，37、200rpm培养3h（受菌体应在对数期为宜，OD600=0.3-0.5）；将菌液分装于1.5mL离心管（1ML/管），置于4冰箱15min；常温，12000rpm离心1min；加入100L0.10moL/LCaCL2，用枪轻吸打散后，置于4冰箱保存20min；常温，12000 rmp离心1min弃上清；再加入100L0.10moL/LCaCL2，用枪轻吸打置于4冰箱4h后离心，弃上清，制得感受态。（5）转化加入10L连接体到感受态中，于4冰块水溶30min；42热激90s，放于冰上3min；加1mL液体LB，37、130rpm摇1h后，3000rpm离心5min；弃LB液体，将剩余混匀，加100L到Amp+抗性LB平板上涂布；37倒置过夜培养。（6）菌液PCR挑取转化平板中的菌于LB液体培养基中，37、200rpm培养5h，获得菌液；菌液PCR步骤、条件、体系同（2），引物不同；菌液 PCR扩增，通用验证引物序列如下：正向引物M13F-47： 5-CgCCAgggTTTTCCCAgTCACgAC-3反向引物M13R-48：5- AgCggATAACAATTTCACACAggA-3（7）用1%琼脂糖凝胶电泳对菌液PCR产额进行电泳、验证后，将菌液送上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。（7）16S rDNA序列分析将测序公司发回的序列通过NCBI网站用BLAST程序进行序列同源性分析。2.2.2.3生理生化实验（糖发酵实验）加入培养液容量1%的糖源和1.6%溴甲酚紫于糖发酵基础培养基中，分装于杜氏发酵管（5mL/支），再在试管内加入倒置的小玻璃管一支，每种糖设2个平行，于121高压灭菌15min；将100L菌液分别接入各发酵管中，以不接种者作为对照，置于30下培养1周。观察记录现象，产酸产气（由紫变黄）用“+”表示，为阳性；无变化用“”表示，为阴性。2.3 菌株作用于酵素中的初探（1）参考徐祖炎的专利制作酵素45：含糖多的水果（苹果）40份，含维生素C多的水果（柠檬）20份，含脂肪多的水果（菠萝）40份，清水洗净加抽烟灭菌30分钟，自然晾干后，将水果粉碎成浆，加入5份酵母菌、8份白糖和5份乳酸菌，于10-19有氧发酵。（2）实验组按（1）制得酵素；对照组，酵素中不加菌，其他不变。（2）发酵20天后测酵素的蛋白酶活力，初步探究所筛菌株在酵素中的应用。第3章 实验结果与讨论3.1 益生菌菌株的筛选3.1.1 初筛（1）用平板稀释涂布法，从酸奶、酒、酒曲和自制酵素按10-110-6梯度稀释涂布，结果在10-1和10-2梯度平板菌落长得太过密集，不易分离；10-410-6梯度平板菌落长得少，甚至不长；而在10-3梯度平板上菌落长得最易分辨，如图3-1。由经验得富集菌株是可直接将样品稀释成10-3梯度涂布于平板，在样品量大的情况下可以节省许多时间。（2）初步筛得42株菌，其中乳酸菌10株，酵母菌18株，霉菌14株。（3）将10株乳酸菌分别编号为L1L10，18株酵母菌分别编号为Y1Y18，14株霉菌编号为M1M14，用40%甘油对其做了长期保藏。a 乳酸菌菌落形态 b 酵母菌菌落形态 c 霉菌菌落形态图3-1 10-3梯度的菌落形态3.1.2 复筛用平板划线法纯化出18类形态特征各不相同的菌株，2类乳酸菌，11类酵母菌，5类霉菌。每类代表性菌株形态特征如表3-2和图3-33-20所示。3.2 菌株蛋白酶活力的测定3.2.1赖氨酸标准曲线的制作如表2-2所示，用吸光光度法测得570nm处各试管中标准赖氨酸的吸光值，制得标准曲线为：y=0.0096x+0.0341（式中：x为氨基酸质量，g；y为吸光值。），变化见图3-2。图3-2 赖氨酸标准曲线3.2.2 菌株蛋白酶活力的测定将复筛得到的42株菌在相应的发酵液中培养2天，测得其蛋白酶活力，由表3-1可知除了Y1、M3没有酶活，其他菌株都有。乳酸菌中L4的蛋白酶活最高，为319.769U/mL；酵母菌中Y14的酶活最高，为237.519U/mL；霉菌中M14酶活最高，为205.363U/mL。表3-1 复筛菌株的蛋白酶活力序号菌株编号蛋白酶活U/mL序号菌株编号蛋白酶活U/mL1L1163.36322Y12130.5502L2115.01923Y13169.7063L3311.23824Y14237.5194L4319.76925Y1588.5505L5267.70626Y16116.113 续表3-1序号菌株编号蛋白酶活U/mL序号菌株编号蛋白酶活U/mL6L6150.67527Y17113.4887L793.14428Y1832.5508L8181.95629M15.8639L957.05030M2191.14410 L10304.01931M30.00014Y4144.76935M734.51915Y591.17536M8170.14416Y6107.14437M957.48817Y7158.76938M10147.39418Y8117.20639M11145.42519Y9202.51940M1275.20620Y10110.42541M13139.30021Y11188.73842M14205.3633.3 菌株鉴定3.3.1 菌落形态及菌体形态观察一共分离纯化得42株菌，其中乳酸菌10株，酵母菌18株，霉菌14株。酸奶中分离得4株乳酸菌；酒中分离得1株酵母菌和5株霉菌；酒曲中分离出9株霉菌；酵素中分离出6株乳酸菌和17株酵母菌。初步判定乳酸菌可分为2类：L1、L4和L5为链球菌；L2、L3和L6L10为乳杆菌，菌落呈乳白色，菌体圆球形、链状。酵母菌有11类：Y1、Y3、Y4和Y8菌株形态类特征似；Y5和Y18类似；Y10和Y16类似；Y11和Y17 类似；其他编号菌株形态特征各不相同。霉菌有5类：M1、M7和M12菌株形态相同；M3和M4类似；M2、M6、M5、M8、M9和M10类似；M13和M14类似；M11形态特征不同于其他菌株。每类代表性菌株形态特征如表3-2和图3-33-20所示。表3-2 获得的菌株的形态特征菌株来源菌落形态菌体形态L3蒙牛酸奶菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，乳白色 短杆状，两杆相连续表3-2 菌株来源菌落形态菌体形态L4蒙牛酸奶菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，乳黄色圆球形，形成链状Y1柿皮、柚子酵素菌落圆形、23cm、微凸起、乳黄色，表面湿润、光滑，边缘整齐，酒香味椭圆形，单边出芽