实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法.ppt

实验二 蛋白质含量的测定凯氏定氮法 一 目的： n学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 n掌握蒸馏、滴定操作技术 三聚氰胺 C3N6H6 “蛋白精” 二、原理：蛋白质含N量约为16，测出含氮量推知蛋白含量 。 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮- -硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂 ，后者提高硫酸沸点。 CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借 水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液 中的氢离子浓度降低，指示剂变色 (NH (NH 4 4) )2 2 SOSO4 4 + 2NaOH + 2NaOH Na Na 2 2 SOSO4 4 + 2H + 2H 2 2 O + 2NHO + 2NH 3 3 NH NH3 3 + HBO + HBO 2 2 NH NH 4 4 BOBO2 2 （ （HH 3 3 BOBO3 3 HBOHBO2 2 + H + H 2 2 OO） 滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度 为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。 NH NH 4 4 BOBO2 2 + HCl + HCl HBO HBO 2 2 +NH+NH 4 4 ClCl 消化 蒸馏、吸收 滴定 三、试剂与器材 1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾硫酸铜混合物 K2S04与CuS04.5H20以 3：1混合 3、30氢氧化钠溶液 4、2硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(约0.01 molL) 6、混合指示剂(田氏指示剂) 由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存 。 酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色 范围很窄且灵敏。 7、待测样品 1. 1.凯氏烧瓶凯氏烧瓶 2. 2.凯氏定氮仪凯氏定氮仪 3. 3.分析天平分析天平 4. 4.酸式滴定管酸式滴定管 5. 5.烘箱烘箱 6. 6.消化炉消化炉 7. 7.容量瓶容量瓶 等等等等 四、操作方法 1. 消化前样品处理 n固体样品: 某一固体样品中的含氮量是 用100g该物质(干重)中所含氮的g数来 表示()。 n固体样品105烘干至恒重。 n用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室 温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干 燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值 不变，即达恒重。 n若样品为液体(如血清等)，可取一定体 积样品直接消化测定。 2、消化 n取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; n1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂 200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中 各加相同量的催化剂和消化液-对照 ，以测定试剂中可能含有的微量含氮物 质。 消化开始时应控制火力，不使液体 冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始 分解并放出SO2白烟后，适当加强火力 消化，直至消化液呈透明淡绿色。 n 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。 加样时应直接送人瓶底，不 要沾在瓶口和瓶颈上。 3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪 n 特点：将蒸汽发生器、蒸 馏器和冷凝器组成一个整 体，体积小，安装容易， 操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱 n关键：搞清水管系统 蒸馏器的洗涤 n.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入 一定量的水(以排水口高度为宜)，酒 精灯加热烧开。 n.水的自动喷出： n将蒸馏水从加样室加入反应室 n将酒精灯移开片刻，反应室内水 自动喷出到蒸汽发生器 n打开蒸汽发生器出水口，放水。 n 如此反复清洗3-5次。 n.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛 有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示 剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装 置内部已洗涤干净。 n 蒸馏吸收 n准备: n取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面 皿覆盖备用。 n关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下， 冷凝器下端浸没在液体内。 n加样: n移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒 加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 n蒸馏: n关闭自由夹，打开冷凝水。 n点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸 馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥 形瓶，表面皿覆盖。 n蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时打 开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。 4、滴定 n全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。 n注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 n 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！ n 及时记录读数 n要求：空白液1次，样品消化液2次 5、计算 n总氮量 () = c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)； V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数； V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数； w为样品重量(1g)。 14为氮的相对量子质量。 消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml 样品蛋白质含量()=总氮量6.25 注意事项 n冷凝水的开、关 n自由夹：中间 n酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够 n蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处 n火焰 n小心照看，防止反应液喷出 n防止烧到橡胶管 n冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染 n空白：蒸10分钟未变色，再蒸3