血细胞分析仪测定原理与参数解析.ppt

血细胞分析仪测定原理与参数解析 太航医院检验科 乔军军 简 介 血细胞分析仪检测原理 血细胞分析仪检测参数原理 检测参数（报警） 临床应用 简 介 自动血细胞分析仪,早年称血细胞技术 仪，已是目前国内外临床检验最常用的筛检 仪器之一。 20世纪50年代初，美国W.H.Coulter 申请了粒子计数法的技术专利，在世界上研 发了第1台电子血细胞技术仪，并应用于临 床，开创了血细胞计数的新纪元。从此，随 着基础医学和高科技，特别是计算机软件技 术的发展，其检测原理逐渐完善，检测技术 不断创新，检测的参数显著增多。 传统手工法显微镜血细胞计数或分类 方法，不仅速度慢，而且因操作过程的随 机误差、实验器材的系统误差和检测方法 的固有误差，检测的精密度不高。 “精度高、速度快、易操作、功能强” 是血细胞分析仪的强劲优势，还可和血涂 片制备和染色仪进行组合，由后者完成血 细胞分析仪检测后的形态学复检。 现代血细胞分析仪的功能有:1.全血细 胞计数功能（红细胞、白细胞和血小板计 数及其相关的计算参数）.2、白细胞分类功 能（三分类或五分类白细胞百分率和绝对 值）.3、血细胞计数和分类功能的扩展功能 ，包括：有核红细胞计数、网织红细胞计 数及其相关参数检测；未成熟粒细胞、幼 稚粒细胞、造血干细胞计数；未成熟血小 板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表 型检测等。 血细胞分析仪检测原理 一、电阻抗法 二、射频电导法 三、激光散射法 悬浮在电解质溶液中的血细胞 相对于电解质溶液为非导电颗粒， 其电阻比电解质溶液大，利用两者 导电性能的差异，体积大小不同的 血细胞（或类似颗粒）通过计数小 孔时，可引起小孔内、外电流或电 压的变化形成与血细胞数量相当、 体积大小相应的脉冲电压，从而间 接区分出细胞群，并分别进行计数 ，这就是电阻抗原理即库尔特原理 。 电阻抗法可精确测量出细胞（ 或类似颗粒）的大小，是三分类血 细胞分析仪的主要应用原理。电阻 抗法还与光学检测原理组合应用于 五分类血细胞分析仪中。 一、电阻抗法血细胞计数原理 电阻抗法细胞计算原理 二、射频电导法 射频指射频电流，是每秒变化 大于10000次的高频交流电磁波。电 导性即电的传送性能。高频电流能 通过细胞壁。用高频电磁探针渗入 细胞膜脂质层可测定细胞的导电性 ，提供细胞内部化学成分、细胞核 和细胞质（如比例）、颗粒成分（ 如大小和密度）等特征性信息。电 导性特别有助于鉴别体积虽相同、 但内部结构性质不同的细胞（或相 似体积的颗粒）如淋巴细胞和嗜碱 性粒细胞两者直径虽均912um， 但在高频电流检测时，因两类细胞 不同核质比例而出现不同的检测信 号。射频电导法结合其他检测原理 一起应用于血细胞分析仪中。 射频电流检测原理 三、激光散色法流式细胞术检测原理 将经试剂稀释、染 色、球形化的细胞（或 其他颗粒）悬液注入鞘 液流中央，单个细胞随 悬液和鞘流液两股液流 整齐排列，以恒定流速 定向通过石英毛细管。 鞘流技术 1.检测光；2.细胞流；3.前鞘流； 4.后鞘流；5.流液方向 三、激光散色法流式细胞术检测原理 当细胞（或其他颗粒）通过激光束 被照射时，细胞（或其他颗粒）因本身 的各种特征（如体积大小、染色程度、 细胞成分浓度或细胞核密度等），可阻 挡或改变激光束的方向，产生与细胞（ 其他颗粒）特征相应的各种角度的散色 光。置放在石英毛细管周围不同角度的 信号检测器（光电倍增管）接受到特征 各异的散色光。来自低角度散色光（或 称前向散色光）的信息，反映细胞（或 其他颗粒）的数量和表面体积大小；来 自高角度散色光（或称侧向散色光）的 信息，反映细胞（或其他颗粒）的内部 颗粒、细胞核等复杂性。 流式细胞术检测通道和光路系统 三、激光散色法流式细胞术检测原理 如细胞（或其他颗粒）用 荧光染料染色,则染色后的细胞 （或其他颗粒）被激光照射时 ，可产生不同波长的荧光散射 ，可用检测器接受散射荧光。 将来自各种散射光的信息进行 综合分析，即可准确区分正常 类型的细胞（其他颗粒）。激 光散射法在区别体积相同而类 型不同的细胞特征时，比电阻 抗法血细胞分群更准确。故激 光散射法已成为现代五分类血 液分析仪的主要检测原理之一 。 激光散射法系统基本组成 名 称组成及评价 光 源气体（氦-氖、氩气等）激光或固体（半导体）激光（单色 光）；钨光源（多色光） 鞘 流维持颗粒于液流中央，顺序、单个、恒速向前流动，即流 体动力学聚集 细胞悬液被检测细胞（颗粒）的悬液，由气压导入流动池 光检测器接受来自各种角度的散射光或吸收光信号，并转换成相应 特征的电信号 血细胞分析仪检测参数原理 一、白细胞系列参数检测原理 二、成熟红细胞系列参数检测原理 三、血小板系列参数检测原理 四、血红蛋白浓度测定检测原理 一、白细胞系列参数检测原理 1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道： （1）4DIFF通道：利用激光流式 细胞术、核酸荧光染色技术，采用专 一溶血剂解红细胞和血小板，而白细 胞膜仅部分溶解出现小开口，核酸荧 光染料聚次甲基进入受损的白细胞内 ，与DNA、RNA和细胞器结合，使之 着色。染色后白细胞色深（未成熟粒 细胞、异常细胞染色更深，成熟白细 胞荧光染色浅），红细胞不染色，血 小板稍染色。因荧光强度与细胞所含 核酸量成比例，从而得到4DIFF白细 胞散点图，包括中性粒细胞和嗜碱性 粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸 性粒细胞（百分率和细胞计数绝对值 ）和未成熟粒细胞（百分率和细胞计 数绝对值）。 白细胞分类4DIFF散点图 1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道： （2）WBC/BASO通道 ：在碱性溶血剂作用下， 除嗜碱性粒细胞外的其他 所有细胞均被溶解或萎缩 ，随后用流式细胞术计数 嗜碱性粒细胞，从而得到 WBC/嗜碱性粒细胞百分率 和细胞计数绝对值及 WBC/BASO散点图。 白细胞分类白细胞、 嗜碱性粒细胞散点图 1、流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道： （3）未成熟粒细胞信息（IMI ）通道：用射频、电阻抗和细胞化 学染色法。在细胞悬液中加硫化氨 基酸，幼稚细胞与硫化氨基酸结合 的量多于较成熟的细胞、且对溶血 剂有抵抗作用。因此，当加入溶血 剂时，成熟细胞被溶解，只留下幼 稚细胞（含未成熟细胞、原始细胞 、造血祖细胞）得以计数。 IMI通 道可定量分析不同类型幼稚细胞， 包括造血祖细胞（HPC）、成熟粒 细胞、原始细胞、异型/异常淋巴 细胞、核左移和有核红细胞，得到 HPC百分率和绝对值计数。 未成熟粒细胞 信息通道散点图 2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS） 用钨光源流式细胞光吸收 、化学染色和电阻抗法：白 细胞计数通道：用电阻抗法检 测。嗜碱性粒细胞通道：用 专用染液染色，嗜碱性粒细胞 具有抗酸性，而其他细胞胞质 溢出，成为裸核，用电阻抗法 检测，用电阻抗法检测，所得 结果与白细胞/血红蛋白通道（ 采用鞘流阻抗法测定白细胞） 的白细胞结果进行比较。 嗜碱性粒细胞计数直方图 2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS） 白细胞分类通道 ：双鞘流系统中，用流 式细胞光吸收、电阻法 和细胞化学染色液对细 胞胞质和蛋白组分染色 ，检测除嗜碱性粒细胞 以外的白细胞；在幼稚 红细胞通道，荧光染色 ，进行白细胞分类。 白细胞分类计数散点图 2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS） DHSS技术：在流式 通道中有2个鞘流装置， 细胞经第1束鞘流后通过 阻抗微孔测定细胞的真实 体积，然后经第2束鞘流 后到达光窗，测定细胞的 光吸收，分析细胞的内部 结构。 双鞘流图 2、双流体（双鞘流）动力连续系统（DHSS） DHSS技术：染色剂中含有溶血 素及氯唑黑E活体染色，溶解红细胞， 对单核细胞初级颗粒、嗜酸性粒细胞 和中性粒细胞特异颗粒进行染色，同 时对细胞膜、核膜、颗粒膜染色，得 到中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒 细胞、淋巴细胞、异型淋巴细胞和巨 大未成熟细胞（LIC）散点图结果。双 矩阵LIC散点图可将幼稚细胞分为3个 亚群：未成熟粒细胞（IMG）：包 括异常中性粒细胞、晚幼粒细胞、中 幼粒细胞、早幼粒细胞、原始粒细胞 。未成熟单核细胞（IMM）：包括 幼稚单核细胞、原始单核细胞。未 成熟淋巴细胞（IML）：包括幼稚淋 巴细胞、原始淋巴细胞等。 双矩阵巨大未成熟细胞（LIC） 散点图 （IMG未成熟粒细胞、IMM未成熟 单核细胞、IML未成熟淋巴细胞 ） 二、成熟红细胞系列参数检测原理 光学法检测网织红细胞、 成熟红细胞和血小板 散点图 1、电阻抗法 依据红细胞大小和数量 进行红细胞计数 2、流式细胞术、鞘流电阻抗 法 红细胞/血小板计数通 道：当红细胞计数你和血小 板计数结果异常时，可提示 转换至Ret/PLT-O光学检测 通道，用光学法测定血小板 （PLT-O），得到与红细胞 计数和血小板计数相关的众 多参数。 正常红细胞直方图 3、流式细胞术激光散射法 红细胞/血小板检测通道：用稀释液十二烷基硫 酸钠（SDS）使红细胞/血小板成为球形并经戊二醛固 定，红细胞被激光照射后，所得信号相同，且不影响 MCV的测定。用低角度光散射测量红细胞体积与总数 ，高角度光散射检测单个血红蛋白浓度，可准确测定 MCV、MCH、MCHC值，得到红细胞散点图；同时可 测定单个红细胞体积及红细胞内血红蛋白含量，得到 相应直方图及RDW、HDW等参数。 三、血小板系列参数检测原理 1、电阻抗法 依据血小板大小和数量进行血小板计数。在电阻抗法血小 板计数时，有的还采用3次计数、扫流和拟合曲线等计数准确 性。 2、流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗法 红细胞/血小板计数通道：用鞘流电阻抗法测定血小板计 数（PLT-I）结果异常时，仪器转换至光学法核酸荧光染色网 织红细胞/血小板检测通道，用光学法测定血小板（PLT-O） 。核酸（DNA/RNA）荧光染色时，未成熟网织血小板染色多 ，成熟血小板染色少，并显示PLT-O散点图结果，可得到未成 熟血小板比率（IPF）、光学法血小板计数（PLT-O）、电阻 抗血小板计数（PLT-I）、血小板比容（PCT）、血小板分布 宽度（PDW）、血小板平均体积（MPV）、大血小板比率（P -LCR）。成熟红细胞无DNA/RNA，不被染色，从而得以在体 积大小和核酸染色上与血小板鉴别。 四、血红蛋白浓度测定检测原理 用光学比色原理测定血红蛋白浓度，有2类稀释液。 1、改良氰化高铁血红蛋白法 测定波长540nm，稀释液含氰化物成分。 2、非氰化高铁血红蛋白法 即稀释液不含氰化物配制的成分。如SLS-Hb测 定法，测定波长555nm。与手工法HiCN测定的相关 性高（r=0.999）。手工法HiCN反应时间长，仅用 于仪器的校准。有些血液分析仪测定血红蛋白，可 兼用非氰化物试剂（如用二甲基月桂胺氧化物）和 氰化物试剂（如用咪唑，含氰化物试剂作用，但无 毒性）。 检 测 参 数（报警） 1、报警的概念 是指所检测的标本不能满足仪器软件系统的定义或不能满足实验 室（用户）建立的检测标准。 （1）报警来源：主要有检测结果超出实验室设定的检测项目 参考值、复检标准，临床疾病标本异常和患者人群变异。 （2）报警形式：主要有图片、符号或文字三种。仪器依据预 先设定的检测数据、大小分布、图形等，作出全面分析和判断，对可 以的阳性检测结果用文字或图示的形式作出解释性、易于理解的报警 信息。如，用红色显示阳性（反之，绿色显示阴性）。出现“阳性”或“ 错误”提示，可能确实是标本出现异常，因此必须根据实验室的规则， 进一步仔细检查。特别须注意出现WBC、DC、RBC、PLT及其相关参 数的数量和形态异常的报警。 （3）报警有效性：仪器以参考方法检测结果作为标准，判断 仪器检测性能指标，包括：灵敏度（S）、特异性（Sp）、阳性预测 值（PPV）、阴性预测值（NPV）和总数率（一致率或符合率）。 （4）报警内容：仪器报警的项目和内容是厂商和用户作出的 定义，内容涉及检测对象年龄、性别、参考值、危急值、红细胞计数 值、血小板计数值、白细胞计数和分类值、细胞形态或可疑的各种异 常信息。血细胞分析仪解释性程序（IP）是仪器依据检测数据、大小 分布、图形的全面分析作出判断，提供易于理解的报警信息，用于对 结果显示和信息的补充，提示浏览屏幕上报警信息。 对同样的内容，各仪器报警形式并不统一。因此，要根据各仪 器的操作手册，仔细理解定义。各类血细胞分析仪常见报警内容见表 ： 血细胞分析仪常见报警内容 类 别 报警内容 红细胞系列 红细胞大小不均、高色素细胞、低色素细胞、大红细胞、小红细 胞、有核红细胞、红细胞碎片、影红细胞、红细胞凝集、红细胞 异常分布、红细胞不溶解、网织红细胞异常散点图、血红蛋白分 布宽度异常、血红蛋白缺乏、血红蛋白干扰等 白细胞系列 杆状核细胞、异型淋巴细胞、非典型淋巴细胞、原始细胞、未成 熟粒细胞、大型非典型未染色有核细胞、杆状核细胞、过氧化物 酶染色异常、异常散点图、核左移、未成熟粒细胞等 血小板系列 血小板凝集、大血小板、血小板异常分布、红细胞碎片等 骨髓造血 原始细胞、大型非典型未染色有核细胞、幼稚细胞等 检测操作 吸样凝块、标本量不足、标本凝固、标本浑浊等 2、标本因素 血细胞分析仪在检测性能上存在的共性问题是 ：在血细胞形态学方面，无论是白细胞五分类还是更 多细胞分类，仍然不能替代人工显微镜检查对复杂的 异常血细胞形态的识别能力。其原因除了血细胞分析 仪检测技术上的局限性外，还受到疾病时标本中已存 在的多种因素的干扰。 标本干扰因素 分析参数 标本干扰因素 白细胞计数和 分类（ WBC,DC） 冷凝集，血小板聚集、大血小板、有核红细胞、冷球蛋白、红细胞不溶解(血 红蛋白病、严重肝病或新生儿患者标本）、冷纤维蛋白原、脆性白细胞、极 端高胆红素血症、髓过氧化物酶缺乏、WBC碎片或其他碎片、白细胞凝集、 HbC结晶、微小凝块（白细胞分类）、高甘油三酯（影响细胞溶解） 红细胞计数（ RBC） 冷凝集，严重小红细胞增多、红细胞碎片、大量巨血小板、体外溶血、WBC 增高、自凝集、小白细胞（当WBC超过100X109/L及MCV增高时）、纤维 蛋白、细胞碎片或其他碎片 血红蛋白浓度 （HGB） 脂蛋白（7g/L）、体内溶血、红细胞不溶解、肝素、血红蛋白结晶、异常 血浆蛋白、严重白细胞增多【 （10250）X109/L】、用非氰化物试剂在 低与25测定血红蛋白 血细胞比容（ HCT） 冷凝集、严重白细胞增多（ 10 X109/L）、异常红细胞脆性、球形红细胞 增多 红细胞平均血红 蛋白含量（ MCH） 随RBC、HGB影响因素而变化 红细胞平均血红 蛋白浓度（ MCHC） 随RBC、HGB影响因素而变化 标本干扰因素 分析参数 标本干扰因素 红细胞平均体积 （MCV） WBC增高伴大红细胞贫血、高血糖、体外溶血、巨大血小板增多、冷凝 集、自凝集、冷球蛋白、高浓度血小板、红细胞碎片36ul、红细胞僵硬 、血小板卫星现象、白细胞碎片、小红细胞，异常血浆蛋白、高葡萄糖血 症、不可逆镰形红细胞 血小板计数（PLT ） 假性血小板减少症、血小板聚集、小红细胞增多、巨血小板、白细胞和红 细胞碎片、血小板碎片、体外溶血、冷球蛋白、体外溶血、自凝集、血小 板卫星现象、电子噪声、肠道高剂量脂质营养患者标本 有核红细胞（ NRBC#） 小淋巴细胞 红细胞分布宽度-s 值（RDW-s） 随RBC影响因素而变化 红细胞分布宽度-cv 值（RDW-cv） 随RBC影响因素而变化 血小板分布宽度（ PDW） 随血小板计数影响因素而变化 平均血小板体积（ MPV） 随血小板计数影响因素而变化 大血小板比率（P- LCR） 随血小板计数影响因素而变化 临 床 应 用 现代血细胞分析仪对生理状态下的血液细胞常规检测 ，包括白细胞分类，已经具备高度的检验精确性和准确性 ；在病理情况下，异常信息可见于现代血细胞分析仪异常 的散点图，此时，应根据不同的病理信息，采用多种参考 方法进行复查。值得注意的是，在显微镜复检上，少花人 力、精力，过分信赖仪器或无视仪器显微镜复检的规则， 将会导致临床对患者诊治的误导。因此，仪器检测结果的 准确性来自临床的客观反馈和循证评价。目前，被批准用 于临床的血细胞分析仪检测参数，包括传统手工检测的红 细胞计数、血小板计数、白细胞计数和分类计数（百分率 和绝对值）、网织红细胞计数（百分率和绝对值）等为早 有明确肯定的临床意义的参数。现代血细胞分析仪随着检 测原理和技术的发展所开发的多种检测新参数，已经或正 在经受实践的验证。以下简介新参数显示的独特临床应用 价值。 一、红细胞系列参数 红细胞体积分布宽度 RDW反映红细胞体积大小不一致的程度，与MCV结合，对贫血 分类诊断和鉴别有临床意义。Bessman提出了贫血的MCV/RDW分类 法，得到6类贫血。 贫血MCV/RDW分类法 MCVRDW分 类意 义 减低正常小细胞均一性轻型-珠蛋白生成障碍性贫血 减低增高小细胞不均一性缺铁性贫血、HbH病 正常正常正细胞均一性慢性病性贫血、白血病 正常增高正细胞不均一性骨髓纤维 化、铁粒幼细胞性贫 血 增高正常大细胞均一性骨髓增生异常综合征 增高增高大细胞不均一性巨幼细胞性贫血、恶性贫血 二、血小板系列参数 血小板平均体积 MPV反映血小板的平均体积大小，主要用于： 1、鉴别PLT减低时的病因 MPV正常或增高，见于骨髓增生功能 良好而外血血小板破坏过多导致的血小板减低性疾病，如特发性血小 板减少性紫癜、脾功能亢进、系统性红斑狼疮等；MPV正常或减低， 见于再生障碍性贫血；MPV减低，见于骨髓病变引起的血小板减低如 急性白血病、艾滋病等。 2、评估骨髓造血功能恢复情况 局部炎症时，骨髓造血受抑制 ，MPV可正常；败血症时，骨髓造血功能受抑制，MPV减低；白血病 缓解时，MPV增高；如MPV和PLT持续减低，为骨髓造血衰竭征兆。 MPV越小，骨髓受抑