DNA重组的的基本操作.ppt

第三章 DNA重组的基本操作 一、核酸的分离提取 二、电泳技术 三、外源DNA片段的制备 四、转化方法 五、重组克隆的挑选 一、核酸的分离提取 (isolate) （一）、DNA的提取 一般原理： 细胞分散：动物组织采用匀浆法；植物组织材料 采用液氮法；微生物材料收集细胞，采用离心法 。 细胞破碎：对于动物材料，直接加入去污剂（多 位SDS),有细胞壁结构的细胞，用分解细胞壁的 酶处理，如溶菌酶处理大肠杆菌；用纤维素酶处 理植物细胞等。然后用去污剂处理使细胞膜破裂 ，原生质体释放。 去除蛋白：蛋白酶K处理；酚/氯仿抽提。 去除RNA: RNase 处理。 核酸沉淀：乙醇沉淀；异丙醇沉淀。 溶解：1XTE 溶解 定性分析：电泳分析，根据标准分子量标准确定 大小、纯度（有无RNA） 定量分析：电泳，以标准含量的DNA确定浓度； 紫外测定OD260。 质量：OD280/OD260. DNA提取操作实例： 质粒DNA的提取 碱裂解法 溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0， 100g/ml RNas A 4oC 保存。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇 1.质粒扩增 1.1.从Amp抗性培养的培养平板上挑取生长状态好的单菌落，置于4ml的 100ug/ml的AmpLB液体培养基中，37，120rpm空气摇床培养4-5小时， 待培养物约为对数生长期，用于扩大培养。 1.2取500ml离心瓶，含有200ml的LB培养基（LB培养基配置见试剂配制） ，将过夜培养物，以备质粒提取。 2.质粒提取 2.1.取250ml离心瓶，将过夜培养物（200ml菌液）倒于离心瓶中， 4000rpm，4，离心15分钟。 2.2.上清液小心转入废液杯中，沉淀为菌体。将沉淀打散，加入4ml质粒 提取液I，室温放置5分钟。 2.3.将所有液体倒入50ml离心管中（以下操作都在50ml离心管中进行）， 加入质粒提取液II 8ml，混合后于室温放置5分钟。加质粒提取液III6ml ，混匀，可见白色沉淀，冰上放置15分钟。 2.4. 10000rpm，4，离心15分钟，取液相。加入等体积的异丙醇混合， 20放置15分钟。 2.5.10000rpm离心,4，15分钟,去上清，沉淀用5ml 1TE溶解后，加5ml 5M LiCl混匀，10000rpm，4离心20分钟。 2.6.取上清，加入等体积异丙醇沉淀，10000rpm离心15分钟。沉淀加入500l 1TE溶液。将所得溶液吸入1.5ml离心管中。再加入3lRNA酶，37放置2小 时（以下操作均在1.5ml离心管中进行）。 2.7.加入等体积聚乙二醇溶液。12000 rpm离心10分钟，收集沉淀。沉淀用 400l 1TE溶解。 2.8.加入400l饱和酚，混匀，12000 rpm，离心3分钟，取上清至新的1.5ml离 心管内。 加入200l饱和酚200l氯仿，混匀，12000 rpm，离心3分钟，取上清至新 的1.5ml离心管内。加入400l氯仿，混匀，12000 rpm，离心3分钟。取水相至 新的1.5ml离心管内。 2.9.加入35ul 3mol/L,然后加NaAC,700l乙醇沉淀混匀，室温放置10分钟后， 于4，12000 rpm，离心5分钟，取沉淀。 2.10.加入200l 80%乙醇洗盐。置于37烘干。 2.11.用100lTE溶解沉淀。 3.检测 3.1电泳检测 3.1.1.配制0.8的琼脂糖凝胶。称取琼脂糖0.24g,置于100ml的三角瓶中，加电 泳缓冲液30ml, 放于水平的桌子上，在三角瓶的水位线处作以标记。 3.1.2.用牛皮纸包瓶口，于微波炉中加热至琼脂融化，取出，放于水平的桌子上 ，用蒸馏水补充到三角瓶的标记处。冷至60时，加溴化乙锭0.005%。 3.1.3.在煮凝胶的同时，准备干净的可盛胶30ml的铸胶托盘一个，用透明胶带封 两边的口。至于水平桌面上，放上1mm厚，5mm宽的梳子。 3.1.4.将凝胶倒入托盘中，自然冷却。 3.1.5.上样1ul，15cm/100V电泳1小时。 3.1.6. 观察RNA和核DNA是否除净。（RNA片段较小，跑在最前面；核DNA片段很 大，位于胶孔跑不出来）。如果核DNA的亮度强于质粒条带，质粒提取不合格， 重新抽提。 3.2OD值的测定 2.2.1.取石英比色杯一支，加3ml蒸馏水，加入DNA溶液10ul用紫外分光光度计测 OD260和O.D280。 2.2.2计算公式: DNA含量（ug/ul）=50XO.D260X3/10 1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种 到液体培养基，37培养1216小时; 2. 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中 ，10000r/min离心1min，去掉上清液， 加入100l溶液1 ，充分混匀; 3. 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH(内 含1SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀， 冰上放置5min; 质粒小量提取的方法： 4. 加入150 l乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7 次混匀，冰上放置515min; 5. 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上 清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混 匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 6. 沉淀用70乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸 上，除尽乙醇，室温自然干燥; 7. 加入30-50l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物 ，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需 要酚:氯仿抽提); 8. 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。 WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega) This purification system is silica membrane-based and modified alkaline lysis procedure based system, which specifically absorbs DNA in the presence of high concentration of some salt. Proteins and other impurities are not absorbed and will be removed. DNA can be eluted under low -salt condition or water. The yield of plasmid DNA will vary depending on a number of factors. Cell Resuspension Solution 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 10mM EDT 100g/ml RNase A Cell Lysis Solution 0.2M NaOH 1% SDS Neutralization Solution 1.32M potassium acetate (pH 4.8) Column Wash Solution 80mM potassium acetate 8.3mM Tris-HCl (pH 7.5) 40M EDTA 55% ethanol TE buffer (1X) 10mM Tris-HCl (pH 7.5) 1mM EDTA 注意： 用移液器（俗称“枪”）操作时 ，每一步都要格外小心，以免切 碎DNA(包括质粒DNA和基因组 DNA); 加入溶液II 和III后，一定不要 剧烈振荡，避免导致基因组DNA的 断裂而污染质粒DNA！ 1. Pellet 13ml of cells by centrifugation for 12 minutes at 10,000 g in a microcentrifuge. Pour off the supernatant and blot the tube upside- down on a paper towel to remove excess media. 2. Completely resuspend the cell pellet in 200l of Cell Resuspension Solution (Solution I）. 3. Add 200l of Cell Lysis Solution (Solution II) and mix by inverting the tube 4 times. The cell suspension should clear immediately. 4. Add 200l of Neutralization Solution (Solution III)and mix by inverting the tube 4 times. 5. Centrifuge the lysate at 10,000 g in a microcentrifuge for 10minutes. 6. Pipet 1ml of the resuspended resin into each barrel of the Minicolumn/syringe assembly. (If crystals or aggregates are present, dissolve by warming the resin to 25 37C for 10 minutes. Cool to 30C before use.) 7. Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing is required. 8. Carefully insert the syringe plunger and gently push the slurry into the minicolumn. 9. Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn. 10.Pipet 2ml of Column Wash Solution (after the addition of ethanol) into the barrel of the Minicolumn/syringe assembly. Insert the plunger into the syringe and gently push the Column Wash Solution through the Minicolumn. 11.Remove the syringe and transfer the Minicolumn to a 1.5ml microcentrifuge tube. Centrifuge the Minicolumn at 10,000 g in a microcentrifuge for 2 minutes to dry the resin. 12.Transfer the Minicolumn to a new 1.5ml microcentrifuge tube. Add 50l of nuclease-free water to the Minicolumn and wait 1 minute. Centrifuge at 10,000 g in a microcentrifuge for 20 seconds to elute the DNA. The DNA will remain intact on the Minicolumn for up to 30 minutes; however, prompt elution will minimize nicking of plasmids in the range of 20kb. 13.Remove and discard the Minicolumn. Follow these storage recommendations: DNA is stable in water without addition of a buffer if stored at 20C or below. DNA is stable at 4C in TE buffer. To store the DNA in TE buffer, add 5l of 10X TE buffer to the 50l of eluted DNA. B. 用分光光度计法定量DNA 1. 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸 馏水对待测DNA样品做1:50(或更高 倍数的稀释); 2. 蒸馏水作为空白,在波长260nm、 280nm处调节紫外分光光度计读数 至零。 3.加入DNA稀释液，测定260nm 及 280nm的吸收值。260nm 读数用于计算 样品中核酸的浓度，OD260值为1相当 于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链 。可根据在260nm以及在280nm的读数 的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯 度。一般DNA的纯品，其比值为1.8， 低于此值说明有蛋白质或其它杂质的 污染。 4. 记录OD值，通过计算确定DNA浓 度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数 以上浓度单位为g /ml 植物总DNA提取 1.植物总DNA提取原理及方法概述 （1）CTAB法 原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去 污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物， 在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降 低溶液盐浓度到一定程度（ 0.3mol/L NaCl ）时 ，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的 复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙 醇使核酸沉淀， CTAB能溶于乙醇。 方法： 1.取1-50克新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉 。 2.将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体 积（w/v）65 预热的2 x CTAB提取缓冲液， 充分混匀， 65 保温10-20分钟，其间不时摇 动。 3.加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管 混匀，室温下12000rpm离心10-20分钟。 4.将上清转入另一离心管中，假如1/10体积的10% CTAB，混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离 心管混匀，室温下12000rpm离心10-20分钟。 5.取上相，重复4操作一次。 6.将上相转入新的离心管，加入1-1.5倍体积的1x CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温下放置30分钟，沉淀 。 7.3500-4000rpm离心5-10分钟，去上清 ，沉淀吹 干。 8.按0.5ml/g材料的比例加入1mol/L乙酸铵溶液， 使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L乙酸铵至终 浓度为2.5mol/L. 9.加入2倍体积的异戊醇，混匀，室温下放置10分 钟。 10. 10000rpm离心5分钟，去上清。 11.用70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量TE 。 优点： 能很好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材 料可优先采用。 （2）SDS法 原理： 利用高浓度的SDS，在较高温度（55-65 ）条 件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出 核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白 质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5mol/L 的KAC于 冰上保温，低温条件下KAC 与蛋白质及多糖结合成不 溶物），离心除去沉淀后，上清中的DNA反复用酚/氯 仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。 （3）植物总DNA提取时常遇到的问题 1.植物材料中含有较多的多酚类物质，使DNA呈褐色 。 解决办法：提高CTAB提取缓冲液中巯基乙醇的含量 或在SDS提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。 2.植物细胞壁难以破碎。 解决办法：在SDS提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷 冻条件下研磨。 植物DNA样品纯度及浓度的鉴定 用于Southern杂交的植物DNA样品 在纯度、长度及浓度上均有较高的要求。 纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限 制性内切酶活性的物质；在长度上不应低 于50kb；浓度应在0.5-1 g/ l之间。 目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光 光度法进行检测。 （1）琼脂糖凝胶电泳 1.所提植物DNA应呈现出一条分子量较大的清 晰条带。如样品呈弥散状，说明DNA已严重降解 ，可能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌； 材料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎 后进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、 吸管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作。 2.如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明RNA 过多，可用RNA酶消化。 3.如在样品槽内有荧光出现，说明DNA未完全 溶解或浓度过高，或样品不纯。 4.估算样品的浓度。 （）紫外分光光度法测定 1.纯度： 纯净的DNA溶液其OD260OD280应为1.8， OD260OD230应大于2.0。 如果OD260OD280大于 1.8，表明应中含有较多的RNA；如果OD260 OD280小于1.6，则说明样品中蛋白质较多； OD260OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的小 分子及盐类杂质，可增加70%乙醇洗涤沉淀的次 数。 2.浓度： DNA样品浓度（ g/ l ）= OD260稀释倍数 0.05 制品说明 本试剂盒用于从血液中提取DNA。通常这种操作非常复杂, 而使 用本试剂盒既可以在短时间内完成 (40分钟) 全部操作, 又可 以获得高纯度的DNA。该DNA可用于包括TaKaRa LA PCR技术在内 的PCR反应和限制酶酶切等实验。本试剂盒既适用于刚采尚未凝 固的全血,又适用于经各种抗凝剂 (柠檬酸、EDTA、肝素) 处理 过的全血。 原理 本试剂盒由GenTLE Solution I、II、III 三部分组成，其中 GenTLE Solution I 的作用是在破坏血细胞的同时，与核酸形 成电中性的复合体，将该复合体离心收集并用GenTLE Solution II 清洗后，在沉淀中加入GenTLE Solution III，将DNA分离出 来，再加入异丙醇将DNA沉淀回收。由于GenTLE Solution I 具 有破坏菌体和病毒粒子的作用，这对于处理那些有可能发生病 原菌等污染的样品非常有利，而且GenTLE Solution I 与核酸 生成的复合体牢固、稳定，便于样品的运输以及大量样品的处 理。 （宝）大连生物工程公司的DNA提取产品 Lane M:-EcoT14 I digest Marker (250 ng) 1:柠檬酸处理血提取DNA 2:EDTA处理血提取DNA 3:肝素处理血提取DNA Bio-Rad 公司的一个提取产品 DNA提取试剂盒 （二）RNA的提取 RNA的提取过程基本与DNA的提取过程相似，同 样有破细胞，除蛋白，沉淀回收RNA样品等过程，其 基本原理也基本一致。所不同的是：由于RNase很稳 定，所以在RNA提取中特别注意的是防止RNase的污 染，导致RNA别降解。通常用1%的DEPC（二乙基焦炭 酸）溶液处理用具。但这样也不能保证彻底灭活 RNase，所以最好的办法是所有离心管，吸头等用品 都一次性使用，操作时要戴上手套避免操作者将 RNase带入样品中去。 RNA提取方法很多，但基本上是采用 酸性盐酸胍酚/氯仿一步法的基础上 进行改进的。该方法的原理是： 1.用胍盐、SDS裂解细胞，灭活RNase 和核蛋白，用酚/氯仿除蛋白； 2.由于在酸性条件下，DNA不溶于水相 ，RNA不溶于有机相，这样可以将RNA和 DNA分开； 3.然后用乙醇或异丙醇沉淀RNA样品。 细胞中的RNA主要有rRNA、tRNA和 mRNA.一般将细胞分离的各种RNA的总和 叫总RNA,某些需要，要纯化mRNA,但多数 情况下，只要获得总RNA就足够了。 RNA用电泳检测是否完整，用紫外方 法定量，用OD260/OD280确定其纯度，一般 要求OD260/OD280 2.0。 RNA提取的一般操作程序： RNA提取试剂： 1.盐酸胍 8Mol/L 2.SDS 10% 3.巯基乙醇 4.NaAC 2Mol/L pH 4.0 1.取1g动物组织于电动组织匀浆器中，加入8ml 试剂1，80ul试剂2，40ul试剂3； 2.开动电动组织匀浆器，均浆约2-3分钟，使组 织充分磨碎； 3.将匀浆液转入一干净的50ml离心管中，加入 2ml试剂4，摇荡混匀； 4.加入8ml水饱和的重蒸酚,2ml含有五十分之一 异戊醇的氯仿，盖上离心管盖子，剧烈震荡10分钟 。 操作程序： 5. 4，12000Xg离心15分钟，将上清液 （含有RNA)转入另一干净离心管中，注意不要 将两相间的沉淀搅混； 6.向含有上清液的离心管中加入等体积的 冷异丙醇，盖上盖子， 4，12000Xg离心15 分钟； 7.去除上清，向沉淀中加入2-3ml 75%冷 乙醇，洗涤沉淀，离心后（同步骤5）去上清 ，沉淀再用75%冷乙醇，洗涤沉淀，离心后（ 同步骤5）去上清； 8.向沉淀中加入500ul 无RNase 的纯水， 溶解沉淀，并转入一干净的eppendorf 离心管 中，-20长期保存。 用Qiagen RNeasy提取试剂盒提取植物总RNA 实验步骤 （每一步均要求无RNase污染 ） 称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； 在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml 离心管中； 待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 450 l提取缓冲液RLT，混匀后在 56下温育13min； 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个2ml收集管，最大转速离心 2min。裂解液通过柱子时被均质化 小心吸取上清液，转移到另一新离 心管； 加入0.5倍体积（225 l）96100% 乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能 会出现沉淀，无影响； 将混合液全部（包括沉淀675 l） 转移到吸附离心柱（粉红色）内， 下接2 ml的收集管，10000 rpm离心 15秒。弃去管内液体； 加入700l RW1缓冲液，10000rpm转 速下离心25秒，弃去收集管； 将离心柱转移到一个新的2ml收集 管上，加入500l RPE缓冲液， 10000 rpm离心15秒，弃去管内液体 重复使用收集管； 加入500l RPE到离心柱内，最大转速 离心2min，干燥离心柱，弃去收集管； 把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管 上，加入3050l 无RNase水（ 0.1%DEPC处理），10000 rpm离心 1min，洗出RNA。若RNA产量在20g 以上，用3050 l无RNase水再洗脱1 次。RNA样品保存于-20备用。 1.凝胶制备（1.2）：用1凝胶缓冲液配 制1.2的凝胶，至少使其凝固30分钟后 进行上样； 2.样品制备：在离心管中，将RNA样品与 10上样缓冲液以9:1比例混匀，迅速在 冰上冷浴5分钟，瞬时离心数秒。RNA上样 量为2-30g，本次实验为10g； 3.上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加 入加样孔，以5V/cm的电压电泳1h1.5h ； 电泳检测RNA： 4.待溴酚蓝迁移至凝胶 长度的4/5处结束电泳 。将凝胶置于溴化乙 锭溶液中染色约30min ； 5.在紫外灯下观察结果 。 上样孔 28S rRNA 23s叶绿体rRNA 18s rRNA 16s 叶绿体rRNA mRNA isolation Only about 3% of total RNA is specific message (mRNA). Most is 28S and 18S eg in 5mg of tissue about 10ug of RNA is present of which 0.3 ug is mRNA, a rare message accounts for 10fg-10pg in total, and a moderately abundant message 300pg How can we isolate such small amounts of message? mRNA isolation We utilise the feature of mRNA, ie the poly A tail Using a column containing a synthetic oligonucleotide oligo(dT) attached hybridise the mRNA to the oligo(dT) and wash away the remainder Elute the mRNA by hot buffer Usually we do two rounds of purification 二、电泳技术 electrophoresis Definition Electro = Charge + Phorsesis= Carry Electrophoresis = Separation of charged molecules by differences in their rate of migration in an electric field. The Components of The System Molecules to be separated Proteins Nucleic Acids Support medium Gel (Starch, Polyacrylamide or Agarose) Buffer System High Buffer Capacity DC Power Source 50 1000 V Common Support Media for Biological Molecules Proteins Native Gel (Acrylamide or Starch) Denaturing (SDS) Gel (Acrylamide) Nucleic Acids DNA simplest separation by size Agarose concentration 0.3-3% Buffer most often Tris-Borate-EDTA (TBE) at 1X or 0.5X; sometimes Tris-Acetate-EDTA (TAE) at 1X Tris is the stronger buffer Detection of DNA is generally by ethidium bromide intercalation (dye in gel, in buffer, in sample, or in immersion solution after run) Agarose Good separation of all but smallest DNAs- mid-range to large pore size provides sieving effect; relatively inert Linear polysaccharide derived from seaweed extract; composed of repeating units of agarobiose When dissolved by heat in aqueous solution, then cooled, agarose solution gels due to formation of inter- and intra-chain H bonds = The higher the concentration, the smaller the pore size 桥式水平电泳槽 用于对DNA、蛋白的鉴定、分离、制备及 分子量测定 Preparing and running an agarose gel Suspend agarose in running buffer (NOT H2O) to desired concentration Heat to boiling; once dissolved, cool to 65oC; add EtBr if desired to 1 g/ml; pour into gel tray with comb to form wells; let set completely Prepare DNA samples- add loading dye to 1X (provides high density to allow sample to sink, and provides dye for monitoring migration) Remove comb from gel, set up in tank and submerge in buffer Load samples by pipetting slowly through buffer into wells Attach leads to tank and power supply; set V so I 3 kb and less than 30 kb) use 0.3-0.5% Running an agarose gel- agarose concentration At low agarose concentrations, very little frictional resistance for small fragment = mobility is similar between different sizes; for high agarose concentrations, very little separation of large DNA fragments of different size because high frictional resistance for all Separation of fragments above 20 kb is not ideal using any normal electrophoresis setup Determining molecular size by determining electrophoretic mobility Dyes provide means of determining endpoint of run and of determining mobility, Mr and estimated size in kb Bromophenol blue and Xylene cyanol are the most common agarose gel tracking dyes. In particular percentage agarose gel, dyes run with characteristic mobility; in general, BPB runs at 0.3-0.6 kb and xylene cyanol at 3-5 kb Determining molecular size by determining electrophoretic mobility Mobility, Mr = distance migrated by band of interest/distance migrated by dye front Mr is related to logMW or log of molecular size in bp in linear fashion, therefore plot standards and can determine unknowns Determining molecular size by determining electrophoretic mobility Distance from origin, cm Log MW 丙烯酰烯酰 胺凝胶电电 泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应 ，可分为连续的和不连续的两类 。 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值 和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳 系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、 pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在 电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力 。 双垂直电泳槽 可用各种凝胶电泳，可同时做两块板 在不连续PAGE系统里，存在三种物 理效应,即电荷效应、分子筛效应和 浓缩效应。 、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。 、分子筛效应：区别不同大小分子种 类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小 的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶 过滤过程中的情况不同。 、浓缩效应 Separating Proteins Based on MW The problem associated with protein separation (too many separation parameters) has been solved by using denaturing SDS Gels The proteins are heat denatured which makes them all the same shape (linear) The proteins are coated with an ionic detergent (SDS) which gives all molecules approximately the same overall negative charge Separation is based on MW alone SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) 三、DNA重组操作 DNA重组操作过程 载体 外源DNA片段 外源DNA插入 剪切 引入宿 主细胞 ab b A 重组 Ab 抗性筛选 重组筛选 （一）DNA的酶切 1. 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。 2.酶切反应系统配制 H2O 达到20ul 10X buffer 2ul DNA 少于5ug(5ul) 酶 于2ul(20个单） 其它试剂，如乙酰化蛋白，牛血清白蛋白等 ，有时不需要 上述反应可按比例放大，但最大体积在 100ul以下为好，按现在的技术，100ul的酶切 产物足够进行后续的操作。 3.保温反应： 温度：根据具体的限制性内切酶的反应要求， 保温可以在恒温水浴锅中，也可以在恒温培养箱 中，也可在PCR扩增仪中进行； 时间：3小时。多数情况下可以考虑酶切过夜 ，因为按照酶的质量要求，反应过夜，仍不会对 DNA用降解作用。 4.检测： 取1ul进行电泳，如果酶切不完全，需要找原 因，将其酶切基本完全。 6.双酶切： 根据重组的需要，有时需要用双酶切，这样重组效果会更好。 双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求 ，有三种情况 兼 容 性 处 理 完全兼容同时加2种酶进行酶切 完全不兼容先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切 相对兼容（其中 一种酶活性相对 较低） 同时加2种酶进行酶切 只是盐离子浓度 不同 先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐。 7.载体的酶切： 酶切条件与外源DNA没有区别。载体多为环 状DNA,如果只有一个酶切位点，用单酶切。另 一种情况是用含有插入子的载体，将插入序列 切除，即可获得载体DNA片段，比较易于获得完 全酶切的载体。因为只一个酶切位点，酶切后 电泳分离时环状和现状DNA有时不能区分。 （二）电泳回收 1.电泳分离：按照常规的琼脂糖凝胶电泳 方法进行电泳分离，用EB染色。 2.挖胶：当电泳使要分离的样品条带分离 ，在紫外灯下将样品连同凝胶挖起来。 3.熔胶：一般加入INa溶液,使凝胶熔解， DNA即释放。 玻璃奶在高盐浓度下Na+能 破坏水中H+和硅基质上O2- 之间的氢氧键,Na+作为一 种阳离子桥梁,能吸引DNA 分子中的磷酸骨架上的O2- (图1).通过对DNA硅胶颗 粒多次洗脱除去盐分后 ,DNA被从硅基质上洗脱下 来,转移到溶液中 4.DNA分离：有两种方式，一种是用特异吸 附DNA的过滤珠，另一种是用石英沙吸收 DNA.当DNA被特异地吸附到固体介质上后， 用一定的溶剂除去凝胶溶液以及其它离子 ，使DNA纯化。 5.用1XTE洗脱DNA样品。 6.回收DNA用电泳方法鉴定。 （三）重组方法： 根据外源DNA和载体条件，其重组方式常 常有以下几种情况： 相同末端：直接将外源DNA和载体片段加 在一起，进行连接。 不同末端：需要将外源DNA和载体DNA的 末端调整成一致。多数情况是变成平末端 ，这可通过DNA酶降解，或DNA聚合酶不平 的方式解决。 单酶切：由于只有一种酶切，载体片段 很容易相互粘连，形成空载体，通常用去 磷酸化的方法以避免。对于表达载体构建 时，还需识别其方向。 双酶切：直接连接，并且方向是确定的 ，所以选择这一方案时，要考虑其方向性 。 （四）连接 一般外源片段较载体摩尔浓度高 ，5：1。有的 加入聚乙二醇。可使反应速度加快。 连接反应： H2O 补充使总体10ul ATP（含在buffer 中） 10XBuffer 1ul 外源DNA 1ul 载体DNA 3-4ul T4DNA连接酶 1ul 四、转化大肠杆菌 1.宿主菌培养 2.制备敏感菌 3.转化 4.铺平板进行扩增和筛选 5.挑选： 选插入片段； 选择需要的克隆 文库筛选 选择正确方向的克隆 1.大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取 一单菌落，接种于35ml LB液体培养中， 37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将 该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体 培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开 始出现混浊后，每隔2030min测一次 OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养； （2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管 中，在冰上冷却20-30min，于4，4000r min离心10min（从这一步开始，所有操 作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的 0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰 浴； （4）04，4000rmin离心10min； （5）弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1 L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000r min离心10min； （6）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1 L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻 后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌 过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置 于-70条件下，可保存半年至一年。 2.细胞转化 (1) 分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操 作)，第一组，加入10 l重组质粒DNA(体 积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管为 转化实验组。第二组，插入DNA片段对照 组，即酶切后DNA片段25ng+100l感受态 细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即 1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100l感 受态细胞悬液。 (2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20- 30min，于42水浴中保温12min，然后 迅速冰上冷却2min (3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体 培养基（不需在冰上操作），使总体积到 0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后 于37振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复 正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因 产物(Ampr)。 3. 平板培养（有时需要稀释） (1)取各样品培养液0.1ml，分别接种于 含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（ 如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后 稍微凉一下再用，不要过烫）。 (2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿 ，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时) ，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培 养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说 ，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转化 菌落足以满足一般的克隆实验。 4.重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互 补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 常用的方法是小