DNS法测定α淀粉酶活力的方法.ppt

利用利用DNSDNS法测定法测定-淀粉酶活力淀粉酶活力 的方法的方法 目的要求目的要求 了解生物学研究中针对糖含量测定的常用了解生物学研究中针对糖含量测定的常用 方法及相关原理。方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握掌握DNSDNS比色法测定比色法测定-淀粉酶活力的原理淀粉酶活力的原理 、方法及操作步骤。、方法及操作步骤。 掌握利用掌握利用EXCELEXCEL分析工具库数据分析分析工具库数据分析 回归分析，得到回归方程及相关分析结果回归分析，得到回归方程及相关分析结果 。 糖的测定方法糖的测定方法 大致可分为三类大致可分为三类： 1.1.物理法物理法旋光法旋光法、折光法折光法、比重法比重法； 2.2.物理化学法物理化学法点位法点位法、极普法极普法、光度光度 法法、色谱法色谱法； 3.3.化学方法化学方法斐林氏法斐林氏法、高锰酸钾法高锰酸钾法、 碘量法碘量法、铁氰化钾法铁氰化钾法、DNSDNS比色法、比色法、蒽蒽酮酮 比色法比色法、咔唑比色法咔唑比色法 生物学研究中关于糖测定中常用生物学研究中关于糖测定中常用 的方法的方法 菲林试剂滴定菲林试剂滴定还原糖，常量分析还原糖，常量分析 DNSDNS比色法比色法还原糖，微量分析还原糖，微量分析 蒽酮比色法蒽酮比色法总糖，微量分析总糖，微量分析 配制系列浓度稀释液的方法配制系列浓度稀释液的方法 线性稀释线性稀释稀释液的浓度梯度是相同的稀释液的浓度梯度是相同的 （0 0，0.20.2，0.40.4，0.60.6，0.80.8，1.01.0） ； 对数稀释（倍数稀释）对数稀释（倍数稀释）系列溶液的浓系列溶液的浓 度比是一常数，取决于稀释梯度度比是一常数，取决于稀释梯度2 2倍稀倍稀 释（释（1 1、1/21/2、1/41/4、1/81/8）；）；1010倍倍 稀释（稀释（1 1、1/101/10、1/1001/100、 1/10001/1000）；）； 调和浓度稀释调和浓度稀释系列溶液的浓度为连续系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（排列整数的倒数（1 1，1/21/2，1/31/3，1/41/4 ，1/51/5）。）。 -淀粉酶酶活力测定的原理淀粉酶酶活力测定的原理 底物（反应物）为淀粉底物（反应物）为淀粉碘比色法（反碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间）应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等产物为麦芽糖、糊精等麦芽糖为还原麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如成量（如DNSDNS法），从而计算出酶活力单法），从而计算出酶活力单 位。位。 DNSDNS试剂测定还原糖的原理试剂测定还原糖的原理 淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-3,5- 二硝基水杨酸还原，生成棕红色的二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-3-氨基氨基-5-5-硝硝 基水杨酸，其反应如下：基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。 用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色 法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量， 以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的 麦芽糖的量表示酶活力。麦芽糖的量表示酶活力。 酶活力测定（酶活力测定（DNSDNS比色法）比色法） 酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 40 ，pH5.6pH5.6或或6.06.0），），1 1分钟反应生成分钟反应生成1mg1mg麦芽麦芽 糖的酶量定义为糖的酶量定义为1 1个酶活力单位。个酶活力单位。 注意：注意：去除去除-淀粉酶的干扰（淀粉酶的干扰（ -淀粉酶不热耐淀粉酶不热耐 ，在，在707015min15min钝化钝化 ）植物材料来源需要植物材料来源需要 注意。本此实验中忽略不计。注意。本此实验中忽略不计。 检测的原理：检测的原理： 酶解的产物之一酶解的产物之一麦芽糖具有还原性，可以使麦芽糖具有还原性，可以使 试剂中的试剂中的3 3，5-5-二硝基水杨酸还原，形成红色的二硝基水杨酸还原，形成红色的 物质，在物质，在540nm540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定下有吸收峰，并和浓度呈一定 线性关系。线性关系。 计算公式：根据标准曲线计算。计算公式：根据标准曲线计算。 3 3，5-5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNSDNS）试剂）试剂 配制说明配制说明 21g 21g 氢氧化钠（先加入溶解）；氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 182g 酒石酸钾钠（同上）；酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS6.3g DNS（3 3，5-5-二硝基水杨酸），加二硝基水杨酸），加 热完全溶于上述溶液中；热完全溶于上述溶液中； 5g 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）；重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；无水亚硫酸钠（冷却后加入）； 完全溶解后定容至完全溶解后定容至1000ml1000ml，贮存时间越，贮存时间越 长越稳定。长越稳定。 引自：引自： 朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城，朱俭，曹凯鸣，周润琦，蔡武城， 袁厚积编著生物化学实验上海：上海袁厚积编著生物化学实验上海：上海 科学技术出版社，科学技术出版社，19811981 标准曲线法标准曲线法 取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液， 在选定波长处（通常为在选定波长处（通常为maxmax），用同样厚），用同样厚 度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（ ODOD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标 作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲 线（工作曲线）。线（工作曲线）。 理想的标准曲线满足以下条件：理想的标准曲线满足以下条件： 1 1、至少、至少5 5个点，一般不超过个点，一般不超过7 7个点；个点； 2 2、2 2个以上重复值；个以上重复值； 3 3、重复值误差小于、重复值误差小于5%5%； 4 4、点与线的垂直距总和最小；、点与线的垂直距总和最小； 注意：注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测标准曲线不能任意延长！（有一定测 定范围）定范围） 理想标准曲线的特点理想标准曲线的特点 过原点的直线；过原点的直线； 斜率为斜率为1 1（4545）； 浓度为待测物质浓浓度为待测物质浓 度的一半二倍；度的一半二倍； ODOD值在值在0.050.050.80.8之之 间（最好控制在间（最好控制在0.2 0.2 0.60.6）。）。 mg/ml 麦芽糖标准曲线的制作麦芽糖标准曲线的制作 取取6 6支干净的具塞刻度支干净的具塞刻度25mL25mL比色管，编号比色管，编号 ，按下表中加入相关试剂；，按下表中加入相关试剂； 混匀后，置沸水浴中煮沸混匀后，置沸水浴中煮沸5min5min。取出后流。取出后流 水冷却，加蒸馏水定容至水冷却，加蒸馏水定容至25mL25mL。以。以1 1号管号管 作为空白调零点，在作为空白调零点，在540nm540nm波长下比色测波长下比色测 定光密度。以麦芽糖含量（定光密度。以麦芽糖含量（mgmg）为横坐标）为横坐标 ，吸光度（，吸光度（ODOD）为纵坐标，绘制标准曲线）为纵坐标，绘制标准曲线 。沸水浴时不要加塞！沸水浴时不要加塞！ 利用利用ExcelExcel中相关统计分析工具，完成回归中相关统计分析工具，完成回归 方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。 相关试剂（第一种）相关试剂（第一种） 标准麦芽糖溶液（标准麦芽糖溶液（1mg/mL1mg/mL）：）：精确称取精确称取 1g1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 1000mL1000mL。 0.1mol/L pH5.60.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：的柠檬酸缓冲液：称取称取 柠檬酸（柠檬酸（C C 6 6 HH 8 8 OO 7 7 HH 2 2 O O ）5.78g5.78g，柠檬酸，柠檬酸 钠（钠（NaNa 3 3C C6 6 HH 5 5 OO 7 7 2H2H 2 2 OO）21.32g 21.32g ，用，用 蒸馏水溶解并定容至蒸馏水溶解并定容至1000mL1000mL。 1%1%马铃薯淀粉溶液：马铃薯淀粉溶液：称取称取1g1g马铃薯淀粉马铃薯淀粉 （105105烘干烘干2hr2hr）溶于）溶于100mL 100mL 0.1mol/L pH5.60.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中的柠檬酸缓冲液中（一（一 般需要密封般需要密封121.3 121.3 灭菌处理灭菌处理20min20min） 。 相关试剂（第二种）相关试剂（第二种） 标准麦芽糖溶液（标准麦芽糖溶液（1mg/mL1mg/mL）：）：精确称取精确称取1g1g麦麦 芽糖，用蒸馏水溶解并定容至芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL1000mL。 0.2mol/L pH6.00.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠磷酸氢二钠- -柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 ：称取磷酸氢二钠（称取磷酸氢二钠（NaNa 2 2 HPOHPO 4 4 .12H.12H 2 2 OO） 45.3g45.3g，柠檬酸（，柠檬酸（C C 6 6 HH 8 8 OO 7 7 HH 2 2 O O ）7.74g7.74g，先，先 在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中 定容至定容至1000mL1000mL。 1%1%马铃薯淀粉溶液：马铃薯淀粉溶液：称取称取1g1g马铃薯淀粉（马铃薯淀粉（ 105105烘干烘干2hr2hr）溶于）溶于100mL 100mL 0.2mol/L 0.2mol/L pH6.0pH6.0 磷酸氢二钠磷酸氢二钠- -柠檬酸缓冲液中柠檬酸缓冲液中（一般需要（一般需要 密封密封121.3 121.3 灭菌处理灭菌处理20min20min）。用时注意酶）。用时注意酶 污染。污染。 标准曲线制作相关试剂加入表标准曲线制作相关试剂加入表 试试试试 剂剂剂剂管管 号号 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 标标标标准麦芽糖溶液准麦芽糖溶液 （mLmL） 0 0 0.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0 蒸蒸馏馏馏馏水水 （mLmL） 2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.4 0 0 麦芽糖含量麦芽糖含量 （mgmg） 0 0 0.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0 DNSDNS试剂试剂试剂试剂 （mLmL） 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0 加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。 预留发酵液酶活力测定预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数需要稀释倍数 1010、100100、10001000、1000010000、 5000050000 对照设置对照设置1 1个就可以，个就可以，1010或或100100倍；倍； 按照按照DNSDNS方法测定。方法测定。 酶活力测定步骤（流程）酶活力测定步骤（流程） 1ml1ml稀释酶液稀释酶液 4040水浴保温水浴保温5min5min 加入加入2.0mlDNS2.0mlDNS 1ml1ml稀释酶液稀释酶液 4040水浴保温水浴保温10min10min 加入加入2.0mlDNS2.0mlDNS 4040水浴保温水浴保温10min10min 沸水浴沸水浴5min5min 沸水浴沸水浴5min5min 冷却定容至冷却定容至25ml25ml 冷却定容至冷却定容至25ml25ml 540nm540nm比色测定比色测定 ODOD值值 540nm540nm作比色调作比色调 “ “0 0” ”、“ “100100” ”用用 加入加入1.0ml1%1.0ml1%淀粉溶液淀粉溶液 （预先（预先4040水浴保温水浴保温5min5min） 加入加入1.0ml1%1.0ml1%淀粉溶液淀粉溶液 （预先（预先4040水浴保温水浴保温5min5min） 4040水浴保温水浴保温5min5min 代入回归方程计算出麦芽糖生成量代入回归方程计算出麦芽糖生成量 计算公式计算公式 N-N-酶液稀释倍数酶液稀释倍数 10-10-反应时间为反应时间为10min10min 注意：标准曲线、酶活力比色测定时使用玻璃比色注意：标准曲线、酶活力比色测定时使用玻璃比色 皿（可见光比色）皿（可见光比色） 酶活力定义：酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为在一定反应条件下（本实验为40 40 ，pH5.6pH5.6或或6.06.0），），1 1分钟反应生成分钟反应生成1mg1mg麦芽糖的麦芽糖的 酶量定义为酶量定义为1 1个酶活力单位。个酶活力单位。 预留发酵液紫外分光光度法测定蛋白质预留发酵液紫外分光光度法测定蛋白质 含量的稀释要求含量的稀释要求 酶溶化后稀释至酶溶化后稀释至5050100100倍测定倍测定A280A280和和 A260A260；以蒸馏水为对照。；以蒸馏水为对照。 代入代入Lowry-Lowry-KalckarKalckar经验公式：经验公式： 蛋白质含量（蛋白质含量（mg/mg/mLmL）=（1.45A1.45A280 280 0.74A0.74A260 260） ）NN 注意：注意：使用使用石英比色皿石英比色皿测定（紫外光比色测定（紫外光比色 用？），石英比色皿较贵，损坏要赔偿！用？），石英比色皿较贵，损坏要赔偿！ ！ 比酶活力计算比酶活力计算 定义：定义：1mg1mg蛋白质的