克隆操作中使用的工具酶.ppt

第一节 基因操作工具酶 第二节 核酸的分离纯化 第三节 聚合酶链式反应（PCR） 第四节 凝胶电泳系统 第五节 核酸的分子杂交 第六节 载体系统 第五章 分子生物学实验技术 第一节 基因操作工具 酶 酶酶 限制性核酸内切酶逆转录酶 DNA连接酶末端转移酶 大肠杆菌DNA聚合酶 S1核酸酶 Klenow酶DNA酶 Taq DNA 聚合酶RNA酶A 多核苷酸激酶碱性磷酸酶 基因工程操作中最常用的工具酶 主要内容 1 限制性核酸内切酶 2 DNA连接酶 3 DNA聚合酶 4 修 饰 酶 5 小 结 酶主要用途 限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子 DNA连接酶连接两个DNA分子或片段 大肠杆菌DNA聚合 酶 或Klenow酶 1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链； 3 填补双链DNA 3凹端；4 DNA测序。 Taq DNA 聚合酶聚合酶链式反应（PCR） 多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针 末端转移酶使3-末端加同聚物尾 S1核酸酶降解单链DNA或RNA DNA酶在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A降解RNA 逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针 碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基 SUMMARY Home 1 限制性核酸内切酶 1.1 1.1 引引 言言 1.2 1.2 命命 名名 1.3 1.3 分分 类类 1.4 1.4 活性及影响因素活性及影响因素 Home 核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键， 导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 （1）按作用对象分: DNAase 小牛肠道: calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) 。 碱性磷酸酶的活性 注意：CIP的比活性比BAP高出10- 20倍，且CIP在SDS中68就可完 全失活，而BAP却是热抗性酶。 Back （1）来源: 前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。 （2）功能：催化DNA进行53方向的聚合作用, 逐个逐个 将将dNTPdNTP分子加到线性分子加到线性DNADNA分子分子3-OH3-OH端端。 4.2 末端转移酶 (terminal transferase) 末端转移酶的催化作用 （3）用途： 给外源DNA片段和及载体加互补 同聚物尾巴； 标记DNA片段的3末端。 Back 4.3 T4多核苷酸激酶 T4 polynucleotide kinase (PNK) （1）来源: T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 （2）功能：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA 或RNA的5-OH末端（图）。 T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应） DNA/RNA（单链或双链） T4多核苷酸激酶的交换活性 过量 （3）用途： 使缺失5-P末端的DNA发 生磷酸化作用； 标记DNA的5-末端。 Back 4.4 S1核酸酶 （1）来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae） （2）功能：切割单链，又称特异单链核酸内切 酶 （3）应用注意：对双链DNA、双链RNA和DNA- RNA杂交体不敏感。 S1核酸酶的活性 （4）用途： 测定真核基因中间隔子序列位置； 去除DNA片段中突出的单链尾巴； 打开cDNA合成时形成的发夹环。 Back 特性 分类 型型型 酶分子三亚基双功能 内切酶和甲基 化酶分开 二亚基双功能 识别位点二分非对称序列 4-6 bp，大多 数为回文结构 5-7 bp非对称序 列 切割位点 距识别位点至少 400 bp，无特异性 在识别位点中 或靠近识别位点 在识别位点24-26 bp 处 限制性反应与 甲基化反应 互斥分开的反应同时竞争 限