《真核基因表达调控》PPT课件.ppt

Chapter 10 真核生物基因表达的调控 第一节 概述 一、真核生物基因表达调控的特点 1、多层次 2、无操纵子和衰减子 3、个体发育复杂 4、受环境影响较小 二、基因表达的时间性及空间性 1时间特异性 按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间 顺序发生，这是基因表达的时间特异性。 多细胞生物 基因表达的时间特异性又称阶段特异性。 2空间特异性 在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织 空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性。又称细 胞特异性或组织特异性。 三、真核生物基因表达调控的 层次： 1、DNA水平调节 2、 转录水平调节 3、转录后水平的调节 4、翻译水平调节 5、翻译后加工的调节 DNA 转录初产物 RNA mRNA 蛋白质前体mRNA降解物 活性蛋白质 DNA水平调节 转录水平调节 转录后水 平的调节 翻译调节 mRNA降解 的调节 翻译后加 工的调节 核 细胞质 第二节 DNA水平的基因表达调控 一、基因扩增(gene amplification) 是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它 使细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发 育的需要，是基因表达调控的一种方式 非洲爪蟾的卵母细胞 rDNA的拷贝数目： 500份 2106份，可装配1012个核糖体 当胚胎期开始，增加的rDNA便失去功能并逐渐消失 二、基因丢失 有的生物在个体发育的早期在体细胞中要丢 失部分染色体，而在生殖细胞中保持全部的 基因组。 小麦瘿蚊（染色丢失了32条，只保留8条） 马蛔虫 三、基因重排(gene rearrangement) 将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近 的位点从而启动转录的基因表达调控方式 基因重排与免疫球蛋白多样性 抗体结构：四聚体, 重链和轻链；可变区和恒定区 链家族 V基因数 C 基因数 人 鼠 人 鼠 链 300 2 6 4 链 300 1000 1 1 重链(H) 300 1000 9 8 V V C C 重链 轻链 基因组成 要点： 1、免疫球蛋白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C 区）以及两者之间的连接区（J区）组成，V、C和J基 因片段在胚胎细胞中相隔较远。 2、在浆细胞成熟过程中，通过染色体内DNA重组把几个 相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生了具有表 达活性免疫球蛋白的基因 3、编码V区的基因很多，而只有少数几个基因编码C区； 多个V区基因中的一个和C基因组合，产生一条DNA 4、V区和C区不同片段在DNA水平上的各种排列组合是 形成Ig分子多态性的根本原因 V “gene” C “gene” Leader Variable J segment Constant Germ line 淋巴细胞 mRNA 链 链 Germ line 淋巴细胞 mRNA Leader Variable J segments Constant 轻链基因的重排 重链基因的重排 Germ line 淋巴细胞 Leader Variable Diversity J segment Constant 1-10 1-4 CH1 Hinge CH2 CH3 四、染色质结构影响基因转录 常染色质（euchromatin）-基因可以转录 异染色质（hetrochromatin）-基因不能转录 活性基因置于异染色质内会失活 位置效应（Position effect） ：指基因转移到基因 组上新位置而引起基因表达的改变 异染色质化：基因组某些区域 被组装成高度压缩 的异染色质的过程 巴氏小体：哺乳类雌体细胞1条X染色体异染色质 化 （雌性X染色体基因表达的蛋白质可能是雄 性的两倍） 剂量补偿：女性两条X染色体的作用与男性一条 X染色体基因产物剂量平衡的现象 五、DNase 的敏感性和基因表达 转录活跃区域对核酸酶的敏感度增加 1、DNase超敏感位点（hypersensitive site）： 具有转录活性的基因周围的DNA区域对 DNase降解高度敏感 。 2、特点： （1）一般在转录起始点附近，即5启动子区域 （2） 低甲基化区 （3）不存在核小体结构 （4）裸露易与反式作用因子结合 六、组蛋白修饰与基因表达调控 （一）组蛋白的修饰： 乙酰化/去乙酰化 （Lys） 转录增强/抑制 甲基化（Lys, His, Arg） 转录增强或抑制 磷酸化（Ser, His） 泛素化 ADP核糖基化 哈佛大学 施洋 - 组蛋白去 甲基化酶 （二）组蛋白乙酰化 1、两种酶 （1）组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase)： 催化组蛋白乙酰化，将乙酰基转移到组蛋白 N端赖 氨酸的-氨基上 乙酰基供体：乙酰辅酶A （2）组蛋白去乙酰酶(Histone deacetylase): 去除乙酰基团 2、组蛋白乙酰化与基因表达调控 （1）关系： 组蛋白的高乙酰化是活跃转录染色质的一个标 志，而低乙酰化则与转录抑制有关 （2）机理： 乙酰基转移到组蛋白 N端赖氨酸的-氨基上， 中和了其正电荷，增加了疏水性，削弱了DNA 与组蛋白的相互作用，有利于转录因子与DNA 的结合，促进转录 七、DNA 甲基化 (一）甲基化酶: 1、维持性甲基化酶(日常型甲基化酶)： 在DNA复制时, 可识别新合成的半甲基化双链, 并将甲基加到新链的非甲基化胞嘧啶上; 2、从头合成型甲基化酶： 不需要甲基化的DNA 模板作指导,可以直接使非 甲基化的DNA 甲基化 （二）原核细胞的DNA甲基化 1、限制修饰系统的甲基化 （1）限制外源DNA： 限制性内切酶切断外源DNA（保护机制） （2）保护自身DNA： 通过内切酶识别位点特定碱基的甲基化保护 自身DNA，每一种DNA内切酶都有一个相关 的甲基化酶 2、Dam甲基化 （1）DNA腺嘌呤甲基化酶：识别序列GATC （2）作用： a、错配修复：识别母链，修正子链 b、转录调节：如抑制转座酶基因的转录， 抑制转座 3、Dcm甲基化（作用不清楚） （三）真核细胞DNA 甲基化 1、甲基化部位： 胞嘧啶（C） 5-甲基胞嘧啶（5-mC） （1）脊椎动物：5-CG-3 （2）植物（两种基序）： 5-CG-3， 5-CNG-3 （3）CpG岛： 富含CpG的一段DNA，一般位于基因启动子附近 特点： a、12kb； b、位于基因5端； c、富含CpG二核苷酸基序 2、甲基化的作用： （1）基因表达调控的一种方式 （2）抑制外源基因的表达 （3）抑制转座子、反转座子的活动 3、DNA甲基化与基因表达调控 基因表达与甲基化呈负相关 DNA甲基化转录抑制作用机理 （1）识别位点中胞嘧啶被甲基化，转录因子不能 与其结合 （2）特异性识别甲基化DNA的蛋白（如MeCP1） 竞争性地抑制了转录因子的结合 （3）DNA甲基化导致染色质结构和DNA构象的改变 4、DNA甲基化与基因组印迹 （1）基因组印迹：来源于父母本的一对等位基因 表达不同（如X染色体失活） （2）基因组印迹的机制-DNA高度甲基化 5、DNA甲基化与X染色体的失活 X染色体DNA序列高度甲基化，基因被关闭 （1）与X染色体的失活有关的序列： X染色体失活中心（Xic） Xist（Xi-specific transcript）基因 转录产物：RNA不编码蛋白质 （2）X染色体的失活的机制： Xist RNA分子与Xic相互作用的结果 （3）Xist基因的调控： DNA甲基化与去甲基化 第三节 转录水平的调控 顺式调控元件(cis-regulating element) 是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活 性只影响其自身同处于一个DNA分子上的基因 反式作用因子(trans-acting factor) 是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而 调控靶基因转录效率的一组蛋白质 转录水平的调控主要是通过顺式调控元件与反式 作用因子相互作用来实现实现的 一、顺式调控元件(cis-regulating element) 启动子、增强子、沉寂子、绝缘子、减弱子、 应答元件 （一）启动子(promoter）) 1、核心启动子（core promoter）： TATA盒 起始子(initiator，Inr) 2、上游启动子（upstream promoter element，UPE） -90bp ：GC盒 ； -70bp ：CAAT盒 （二）增强子(enhancer) 能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件 1、举例： SV40 72bp repeats (paired) 上游200bp 处串联, 单独作用充分, 全部缺失减 弱转录 2、真核细胞的增强子作用特点： （1）能提高同一条链上的靶基因转录速率； （2）增强效应与其位置和取向无关 （3）大多为重复序列，核心序列为 (G)TGGA/TA/TA/T(G) （4）增强子对同源基因或异源基因同样有效自身 （5）增强子一般具有组织或细胞特异性 （6）许多增强子还受外部信号的调控 3、增强子作用机理-成环模型 增强子通过一些蛋白质因子的介导可与远距离的启动 子结合，使DNA形成了一个环，从而促使远距离的启 动子的转录 （三）上游激活序列（upstream activating sequences，UASs ） 特点 1、UASs是酵母中远上游序列类似于增强子。 2、它仅影响转录效率，对起始位点选择不起作用 。 3、和增强子不同的是它有方向性，不能在启动子 的下游起作用。 4、与它结合的转录因子是GCN4和GAL4，识别位 点为 ATGACTCAT。 （四）绝缘子(Insulator) 阻止激活或失活效应的元件 举例： 1、当绝缘子位于增强子和启动子间时，能阻止 增强子激活启动子作用。 2、当绝缘子位于一个活化基因和异染色质之间 时，它保护基因免受由异染色质扩展造成的失 活效应影响。 （五）减弱子（dehancer） 在某些基因的上游远端或下游远端具有负调 节作用的序列 特点： 作用不受距离和方向的影响 （六）沉寂子(silencer) ： 阻遏某些基因表达的序列 特点： 作用不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用 （七）应答元件（response element） 能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制 基因特异表达的DNA上游序列 如 HSE（热休克反应元件）， GRE（糖皮质激素反应元件）； MRE（金属反应元件）； 应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因 子识别 应答元件 (response elements) 结合蛋白 (protein binding) GREBLEBLEMREMREMREMRETREGCTATA Steroid- receptor AP2AP2 AP1? SP1 TF IID + RNApol BLEbasal level element MRE metal response element APactivator protein 人金属硫蛋白基因启动区结构 应答元件的特点： 1. 具有与启动子、增强子同样的一般特性. 2. 与起始点的位置不固定（多在-200以内;单个功能充分, 但多为多拷贝;可位于启动子/增强子内部）. 3. 多基因由同一因子调控（如：热激效应） 4. 同一基因由多种途径调控（如：金属硫蛋白基因）. 5. 各效应元件不论位置如何都有独立的活化功能. 二、反式作用因子 (trans-acting factor) DNA结合结构域(DNA binding domain) -用来结合DNA 反式激活结构域(Transactivation domain) -用来激活转录 （一）转录因子DNA结合域 几种常见基序 锌指(zinc finger) 螺旋-转角-螺旋 (helix- turn- helix) 二聚体结构域： 螺旋-环-螺旋 (helix- loop- helix，HLH ) 亮氨酸拉链 (Leucine zipper) 1、锌指(zinc finger) C2H2型：由肽链的保守序列 中的一对组氨酸和一对半 胱氨酸(His2Cys2)与锌 离子形成一个四面体结构 有两条链和一个螺旋 ， 螺旋区域上含有保守 的碱性氨基酸，负责与 DNA结合 如TFIIIA、与GC盒结合的 SPl C2H2型 C4型： 2对半胱氨酸(cys2cys2)与一个锌离子形成配位键， 如类固醇激素受体家族 2、螺旋-转角-螺旋 (helix- turn- helix) 两段螺旋被一短的转角结构分开 多种果蝇胚胎发生的调节蛋白，同源异型蛋白 1 3 2 3、亮氨酸拉链 (Leucine zipper) 由一段每7个氨基酸残基就 有一个Leu的伸展肽链组成 ，这些周期性出现的Leu都 位于-螺旋的同一侧面， 形成一个疏水的表面，因 此两条均含Leu拉链基序的 蛋白质通过亮氨酸侧链的 疏水作用形成二聚体。 LL LL LL LL + + + + + + + + NH2 NH2 COOHCOOH 肽链氨基端富含碱性 氨基酸残基区，可与 DNA结合 碱性结构域 富含碱性氨基酸残基 在许多DNA结合蛋白质中发现 通常与其他的二聚体结构域如亮氨酸拉链或HLH基序 中的一个联合在一起，结果被称为碱性亮氨酸拉链（ bZIP）或碱性HLH（bHLH）蛋白。 蛋白质二聚体使两个碱性结构域相邻进而可与DNA发 生作用。 N-端碱性结构域形成一个对称结构，象一个夹子 夹在DNA上 + + + + + + 4、螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix) HLH由2个螺旋间隔一个 非螺旋的环(loop)组成 ，通 过C端螺旋的疏水作用形 成二聚体 碱性结构域 碱性HLH蛋白与碱性亮氨 酸拉链这种异二聚体的形成 增加了转录因子的多样性和 复杂性 NH2 NH2 COOHCOOH （二）转录激活结构域 是反式作用因子的转录调控结构域，一般由DNA结合 结构域外的30-100个氨基酸组成 1酸性结构域 n 也叫做“酸斑（ acid blobs）”或“带负电的长链 （ negative noodles）” n 富含酸性氨基酸 n 存在于许多转录因子的激活结构域中， 如：yeast Gcn4 and Gal4, 哺乳动物的糖皮质激素受体的两个激活结构域 2富含谷氨酰胺激活结构域： 富含谷氨酰胺 （SP1，OCT1，OCT 2，SRF等） 3富含脯氨酸激活结构域 富含脯氨酸 有一个能激活转录的连续脯氨酸残基链 （AP2、Jun、SRF 等） 4、转录因子的活化途径： （1）需要时蛋白被合成，但很快被降解，不能积累。 （2）通过与配体结合被活化。 （3）通过磷酸化被活化。 （4）结合DNA亚基的加入，与带有转录激活结构域的蛋 白质形成复合物。 （5）通过抑制因子的磷酸化，暴露隐蔽的活化区域。 （6）通过去除一个抑制蛋白，刺激转录因子入核。 三、转录调控举例 1、组成性转录因子：SP1 与富含GC的保守序列GGGCGG相结合. 结合位点存在于许多持家基因的启动子中。 是一个组成性转录因子，存在于所有的细胞类型中。 包含3个锌指结构域以及2个富含谷氨酰氨转录激活结 构域。 SP1的富含谷氨酰氨结构域与TAF110发生特异作用， TAF110是TAF中的一种，后者与TATA结合蛋白（ TBP）相结合组成TFD。 2. 激素调控: 类固醇激素 （如糖皮质激素） n脂溶性的， n能够穿过细胞膜与 类固醇激素受体（ 转录因子）相互作 用。 steroid GRE Inhibitor(HSP90) Glucocorticoid receptor Dissociation, dimerization n在没有类固醇激素时，该受体与抑制蛋白结合，游离 在细胞质中. n有类固醇激素时, 1.激素结合到受体上，将其从阻抑物中释放出来。 2.受体二聚化并转移到核中。 3.受体与其特异的DNA结合序列结合 (应答元件) ，从 而激活靶基因。 3. 通过磷酸化调控： STAT蛋白 许多激素不能扩散进细胞。 它们通过与细胞表面的受体结合，通过称为信号转导 的过程将信号传递给细胞内部的蛋白。 信号转导通常涉及到蛋白质的磷酸化。 如-干扰素通过激活一种称为JAK的激酶诱发转录 因子STAT1 的磷酸化 3. 通过磷酸化调控： STAT蛋白 PP PP Interferon- IFN- receptor JAK kinase Unphosphorylated STAT monomers +2ATP dimerization +2ADP phosphorylated STAT1 dimer Nuclear translocation Response element 3. 通过磷酸化调控： STAT蛋白 （1）未磷酸化的STAT1 蛋白: 以单体形式存在于细 胞质中，无转录活性。 （2）在特异的酪氨酸残基磷酸化的 STAT1 形 成同 型二聚体进入核，激活在启动子处含有保守的DNA 结合基序的靶 基因的表达。 第四节 转录后水平的基因表达调控 一、RNA沉默与siRNA （一）基因沉默（gene silencing）： 指生物体中特定基因由于种种原因不能表达 或表达量很低的遗传现象。 （二）基因沉默类型： 转录水平的基因沉默(TGS) 转录后水平的基因沉默(PTGS) DNAmRNAProtein DNAmRNAProtein 1、定义（Definition）: 是由dsRNA介导的，通过目标mRNA的降解 而使特定基因沉默的现象。 （三）RNA Silencing DNAmRNAProtein RNA干涉（RNA interference，RNAi）：In animal 转录后水平的基因沉默-PTGS （In plants） 静息或阻抑作用- quelling（ In certain fungi） 2、Other names of RNA silencing 3、RNA沉默的发现 Untransformed Napoli, Lemieuz, Jorgensen, 1990 Van der Krol, Mur, Beld, Mol, Stuitje, 1990 35S-PChalcone synthase Nos-T “Cosuppression” RNA silencing first observed in plants during transgene studies Fire（美国卡内矶研究所） Mello（美国麻州大学） 双链RNA 是导致线虫par-1基因 沉默的原因， 并称之为RNA干扰(RNA interference)。 Guo & Kemphuse（美国康乃尔大学） 正义和反义RNA都能导致线虫par-1基因 沉默。 Degraded RNA (Gene silencing or virus resistance) DICER (dsRNase) (DCLs) 21-25nt small RNAs (siRNAs) Complex formation RISC complex Target ss mRNA or viral RNA Endonuclease(s) Exonuclease(s) dsRNA RdRP Amplification Systemic silencing Long-distance signals CH3CH3CH3 Homologous DNA RNA-directed DNA methylation 4、RNA沉默的可能机理 5、RNA沉默的功能 v PTGS在生物界中是一种普 遍现象，是真核生 物长期进化过程中形成的一种抵御病毒、转座 子等外来核酸的入侵、识别并抑制外源基因的 表达，维持生物基因组稳定性的重要防御机制 。 6、RNA沉默应用 Applications of RNA silencing （1）基因功能分析 （2）培育抗病毒作物 （3）作物品质遗传改良 How to Silencing a Gene hairpin RNA transgene AAAAAAA- complementary regions PromoterTerminator mRNA Hairpin RNA 二、MiRNA (MicroRNA)与基因表达调控 （一）特点： 1、miRNAs是一种2125nt长的小分子RNA 2、具有高度的保守性、时序性和组织特异性 3、主要作用于靶标基因3-UTR区 ，阻遏翻译 （二）功能： 主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达 （三）MiRNA的生成及作用机制 MiRNA作用模式 1、与靶标基因3-UTR区不完全互补结合，阻遏翻译而不 影响mRNA的稳定性（这种miRNA是目前发现最多的种类 ，如线虫lin-4） 2、与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非 常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA 一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。（如 拟南芥miR-171） 3、具有以上两种作用模式，当与靶标基因完全互补结合 时，直接靶向切割mRNA；当与靶标基因不完全互补结 合时，阻遏基因的翻译（如线虫let-7 ） （四）小RNA的研究的启示 1、基因组非蛋白编码区可能蕴含着重要的生命 功能活动信息。 2、生命的一些重要活动如幼虫的生长发育、细 胞的发生和分化、神经系统的分化等都被一些 非编码小RNA的调控 附：RNA的功能 （1）储存遗传信息，如RNA病毒 （2）mRNA：进行遗传信息的传递，作为蛋白质合成的模板 （3）rRNA：可装配成核糖体，参与蛋白质合成 （4）tRNA：携带氨基酸，参与蛋白质的合成 （5）核酶：内含子的自我剪接等 （6）MicroRNA：基因表达的调控，在发育过程中起作用 （7）SiRNA：抑制病毒、转座子等外源基因的表达 （8）指导RNA：参与RNA的编辑 （9）SnoRNA：可能与RNA的甲基化有关 （10）SnRNA：参与RNA的加工（如剪接） （