《牙周病分子生物学》PPT课件.ppt

牙周病分子生物学 Molecular Biology of Periodontal Diseases 李 德 懿 上海第二医科大学附属第九人民医院 一、概述 二、牙周病的分子致病 1.微生物的毒力因子 2.宿主因子 三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌 定义（Definition） 分子生物学技术研究与牙周病密切相 关生物大分子（蛋白、核酸）的一门新 兴学科前瞻性、交叉性。 研究内容 4宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流行 规律 4牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子结构 追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。 4牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因特 征联系起来牙周病临床的分子诊断、分子指征、 分子预后乃至基因治疗 牙周病的分子致病 Molecular Pathogenesis of Periodontal Disease 微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子 结构，评价毒力因子的作用。 宿主因子 研究细胞因子和遗传因子的作用。 微生物的毒力因子 Microbial Viralence Factors 内毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成分 （磷脂多糖蛋白质）。 十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳 PAGE-SDS gel 银染色 Silver stain 内毒素免疫印迹 LPS-immuno-blotting 牙龈素(gingipains) 最初称为胰酶样蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又称卟啉素(porphypains) 存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶 超速离心(10000g20min,4)提取胞外膜 泡高凝胶液相色谱法(GF-HPLC)分离纯 化。 精氨酸牙龈素(Arginine-gingipains, Rgps): 特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段，由 rgpA(前肽区、蛋白酶区、粘附区)和rgpB(无粘 附区)二个基因编码 赖氨酸牙龈素(Lysine-gingipain, Kgp): 特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由 kgp(前肽区、蛋白酶区、粘附区)单个基因编码 Pg同源突变株的性状改变 突变株性状改变 rgpA粘附能力部分丧失 降解I型胶原能力丧失 rgpA、rgpB 抑制中性粒细胞功能丧失 菌毛缺失 kgp菌落无法变黑(影响利用血红蛋白) rgpA、rgpB、kgp胞外蛋白水解活性丧失 牙龈素功能 有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。 毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白、多肽) 、降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加 龈沟液量，组织水肿。 帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细菌 营养摄取范围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。 干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主细 胞的LPS受体CD14，降解细胞因子IL-1、IL-6、IL-8及 TNF等。 菌毛亚单位蛋白结构基因(fim A) 粘附有关的毒力因子 纤毛素(fimbrilin) 粘附素(adhesin) 血细胞凝集素 (hemagglutinin) 1988年Dickinson等首先获得含编码Pg 纤毛素基因的克隆质粒PUC 13Bg12.1，该 基因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基 酸序列与其他菌毛无同源性，可利用该特 异基因作探针鉴定Pg，可进一步研究Pg菌 毛的致病作用。 胶原酶基因(prtc) Pg的胶原酶能降解I型胶原，破坏 牙周组织附着。 已测知表达胶原酶活性的prtc基因 序列，它存在于Pg的三种主要血清型 中，编码1个37501.38蛋白质。 白细胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能产生白细胞毒素 (leukotoxin,LKT)的细菌，白细胞毒素仅 能杀死人或灵长类的多形核白细胞、单核 细胞和巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防 御机制。 现已克隆和测知lkt A的序列，且在受 体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白 细胞毒素。 宿主因子 Host Factors 细胞因子(cytokines) 细胞生物学 细胞因子cytokine(CK) 免疫学淋巴因子lymphokine interleukincytikine(LI) 血液学集落刺激因子 colony stimulation factor(CSF) 分子生物学 生长因子growth factors(GFS) 活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的微量 生物活性物质。 本质是蛋白质或多肽。 在体内发挥广泛的生物学作用，与生长、分 化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种生 理、病理状态有关。 正常情况下发挥广泛生理功能，一旦失调异 常分泌，又与疾病相关。 目前发现的细胞因子有10余族， 每族又有若干亚族，共100多种，功 能大多已阐明，部分已克隆成功，其 基因定位、结构与受体结合机制等均 有大量研究。 6 白介素(1-18型糖蛋白)(interleukin, IL) 6 肿瘤坏死因子(tumor nocrosis factor, TNF) 6 粘附分子(adhesion molecule, AM) 6 干扰素(interferan, IFN) 6 转化生长因子-(transforming growth factor- , TGF- ) 6 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs) 细胞因子作用特点 4特异性(自分泌、旁分泌作用) 对靶细胞存在不同程度特异性。 4多样性、多功能性 对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状态靶 细胞可有不同作用。 4整体性 对细胞、组织的调控不是仅靠1种，而是多因 子参与及多步骤反应，由几种因子协同或拮 抗配合形成网络(network)发挥作用。 遗传因子(genetic factors) 基因水平阐明牙周病发生、发 展和流行规律。 细菌是引发牙周炎必不可少的因素，但 不是唯一因素，宿主也起重要作用。 单纯遗传能为患严重牙周炎提供50%以 上危险性，如： 白细胞减少症 白细胞粘附缺陷病 Down综合征 掌跖角化牙周破坏综合征 牙周病的基因研究 6号染色体组织相容性位点变异 产生IgG2能力降低， IgG2是保护性的，能调理识别 细菌，以利吞噬杀死。 染色体1q H131残基多态性 组氨酸纯合子 吞噬细胞识别IgG2的hFcrRa 受体亲和力高(IgG包裹的致病 菌易被吞噬清除) 精氨酸纯合子 受体亲和力低 组/精氨酸杂合子 亲和力居中 染色体2q 13的IL-1基因多态性 产生的IL-1约为该基因阴性的4倍，40 岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体 的20倍 6号染色体TNF-基因多态性 产生大量TNF-，增强对感染的反应性 核酸杂交法 (molecular hybridization) 检测牙周病相关细菌 概 述 细菌分类学四个水平 w细菌形态和行为水平：显微结构、运动性 、酶、生化及营养需要等 w细菌组分水平：胞壁组分、脂类、细胞色 素及噬菌体系分析 w蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝 胶电泳及血清学 w基因水平：GC mol%，DNA-DNA杂交 ，质粒及遗传物质的转导 牙周病有关的特殊细菌 证据充分的致病菌中等证据的致病菌 伴放线放线杆菌Aa直肠弯曲菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)(campylobacter rectus) 牙龈卟啉单胞菌Pg缠结优杆菌 (Porphyromonas gingivalis)(Eubacterium nodatum) 福塞似杆菌Bf具核梭杆菌Fn (Bacteroides forsythus)(Fusobacteruim nucleatum) 中间普氏菌Pi (prevotella intermedia) 微小消化链球菌Pm (Peptostreptocoscus micros) 中间链球菌群 (Intermedius streptococci) 牙密螺旋体Td (Treponema denticola) 常规方法不能鉴定牙周大量标本细菌的原因： X大多为厌氧菌 X培养条件要求高 X鉴定繁杂 X每牙周袋至少取2个区样本 X每样本至少分离10株以上可疑菌 原理 所有生物体都以DNA形式通过4种碱基顺 序来贮存遗传信息，同种生物含相同的DNA 序列，生物种差别越大，DNA碱基顺序差别 越大。 鸟嘌呤 腺嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 G A C T C T 示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段， 能和互补碱基配对、特异地结合。 w4种核苷酸组成DNA w2条互补链绕成双螺旋结构(氢键)严格 配对规律牢固结合，使DNA具遗传信息 贮存库功能（恒定性、专一性） wDNA上相邻3个核苷酸编排1个密码子 ，决定1个特定氨基酸 wDNA核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺 序决定细胞结构和功能 核酸探针(probe) 定义 能与特定核酸序列发生特异性互补 的已知核酸片段，用于检测待测样品中 是否存在与探针相同或相近的DNA序列 。 牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相关 菌染色体DNA上的有种属特异性的一小段 DNA（或RNA）分子的碱基序列，为带标 记的单股核苷酸，能以互补方式与相应 DNA键结合。用已知细菌的DNA探针去探 测未知细菌的DNA，若能杂交形成DNA双 链则认为该菌为与探针相同的菌。 放射性同位素标记：如 32P、35S、3H 灵敏度高 理化影响小 污染环境 使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、荧光素 特异性较低 敏感性较低 合成小段单链DNA方法日臻完善 寡核苷酸的化学合成可由高度自动化 的仪器完成 核酸杂交技术得到发展 探针类型 w全基因探针：属内代表菌株分离出DNA并进行标记，制 备简便，特异性较差，有时可与相近属菌种发生杂交 w克隆DNA片段探针 随意探针：代表菌DNA用限制性内切酶酶切，随意克隆 一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的DNA片段 特异性高，但需大量试验方能验证其特异性 w特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基 因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作 用，但需对其特异性、敏感性验证 探针的验证 w特异性验证： 必须与50种菌属的80300株菌株进行杂交 必须与相近细菌属中的大量菌间排除“交叉杂交” 如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株 w敏感性验证： 必须与同属各地区分离的100株以上菌种进行杂交 如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应 进一步验证生化结果。 寡核苷酸(oligonucleotide)探针序列 细菌 探针名称 序列 AaAa-2 CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCC PgPg-1CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC Pg-3CTGTGGAATCTTGACGGTATATCG Pg-4GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTT Pg-5CCGATGCTTATTCTTACGGTACAT Pg-6CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGC BfBf-2CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTA Bf-4CTGTAGAGCTTACACTATATCGCA PiPi-1GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGC Pi-2CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA 特定DNA片段探针序列（基因探针） 细菌 靶基因 序列 长度 AaLkta5-CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA-3238bp 5-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3 16Sr DNA5-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3443bp 5-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3 16Sr DNA 5-CTCAGAGATGGTTTGTGCC-3 273bp 5-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3 Pg Fim A5-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3131bp 5-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3 Prt C5-ACAATCCACGAGACCATC-3584bp 5-TTCAGCCACACCGAGACG-3 16Sr DNA5-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3404bp 5-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3 续表 细菌 靶基因 序列 长度 Pg16Sr RNA5-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3 518bp 5-GTTTCAACGGCAGGCTGAAC-3 Fn50475-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-30.5Kb 5-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3 505905-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT-31Kb 5-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3 Pi 18Sr RNA 5-CCTAATACCCGATGTCCACA-3 855bp 5-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3 TdTdpA5-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3 311bp 5-AGCCGCTGTCGAAAAGCCA-3 PCR扩增16SrRNA 基因病原菌检测 遗传学分类 rRNA是细胞中最多的一种RHA，很多 分子组成核蛋白体(核糖体)，rRNA分子大 小一般用超速离心的沉降系数S表示，S越 大，分子也越大。 16SrRNA基因：细菌染色体上编码 rRNA相对应的DNA序列 4保守区稳定性（细菌共有，称“分子化石” ） 4可变区特异性（保守区间有V1V10可变区 ，含种属差异信息，如出现3个碱基以上差 异，便可判定不同属） 4多拷贝敏感性（约1500个核苷酸，每