分子生物学研究质粒抽提.ppt

实验一 质粒DNA提取 一、原理 v在碱性溶液中，细菌的线性大分子量染色体双链 DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构破坏而发生变性； 而质粒DNA由于分子量相对较小，且呈环状超螺旋 结构，在高碱性条件下，虽然变性但仍处于拓朴缠绕 状态,两条互补链不会充分分离，当加入中和缓冲液 时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性 的分子量较大的细菌染色体DNA则不能复性，与细 胞碎片、蛋白SDS等形成不溶性复合物，可通过离 心沉淀被去除。而质粒DNA及小分子量的RNA则留 在上清液中，残留的RNA可用RNA酶去除。残留的 蛋白质可用酚/氯仿去除,进而得到纯化的质粒DNA。 二、材料与试剂 含pET28-gene的E. coli DH5菌液 （用试剂盒抽提）（用溶液I II III 抽提） 质粒抽提主要溶液： 溶液 (P1)：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0) ， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液 (P2)：0.2 mol/L NaOH ，1 SDS。 溶液 (P3)：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml, 至100ml 。 v：试剂中所用葡萄糖有增加粘度，降 低剪切率，减少DNA的降解； v ：试剂中所用EDTA有抑制DNase的 作用，还能降低离子浓度； v3 ：SDS能使蛋白变性并形成不溶性复合 物； v 4：试剂中所用NaOH能使DNA变性， KAc-冰醋酸能使DNA复性，并有助于蛋 白等其它大分子成分沉淀。 一、步骤及原理 v从细菌中分离质粒DNA 的方法都包 括3 个基本步骤： v(1)培养细菌使质粒扩增； v(2)收集和裂解细胞; v(3)分离和纯化质粒DNA。 三、操作步骤 (一) 细菌的培养和收集 v将含有pET28-gene的DH5菌种接种在LB 固体培养基中, 37培养12-24 小时。 v用无菌牙签挑取单菌落接种到50ml LB 液体培养基(含Kan)中 ,37振荡培养约12 小时至对数生长后期。 （二）碱法抽提质粒DNA 1、取1.4 ml 培养菌液至1.5ml 离心管中, 10000 rpm 离心2min。弃上清,再 吸取1.4 ml 培养菌液于同一离心管， 10000 rpm 离心2min将管倒置于卫 生纸上数分钟,使液体流尽. 2、菌体沉淀重悬浮于150l 溶液中(需剧烈振荡), 3、加入新配制的溶液200l, 盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容 物(千万不要振荡), 室温放置2-5 分钟。 4、加入180l 预冷的溶液, 盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使 沉淀混匀, -20放置5分钟, 10000 rpm 离心10 分钟。 5、上清液移入干净离心管中,加入等体积的氯仿, 振荡混匀, 10000 rpm 离心 5分钟。 6、将水相移入干净离心 管中, 加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于- 20冰箱中20分钟，然后4下12000 rpm 离心10 分钟。 7、弃上清,将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉 淀, 4下12000g 离心5分钟。 8、吸除上清液,将管倒置于纸巾上使液体流尽, 室温干燥。 9、将沉淀溶于30l TE 缓冲液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，37 放置 1h, 然后储于-20冰箱中。 （二）TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒DNA 1、柱平衡：向吸附柱CP3加入500ul平衡液BL，10000g离 心1min。 2、取1.4 ml 培养菌液至1.5ml 离心管中, 10000g 离心 2min，弃上清（重复一次）,将管倒置于纸巾上数分钟, 使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于250l 溶液P1中, 振荡使彻底悬浮。 4、加入250l溶液P2, 温和颠倒离心管6-8次,混匀内容物。 5、加入350l 溶液P3,温和颠倒离心管6-8次,使沉淀混匀, 10000g 离心10 min。 6、将上清液转移至吸附柱CP3中（不要吸沉淀）,10000g 离心1min, 弃收集管中的废液。 7、向吸附柱CP3加入700ul漂洗液PW, 10000g 离心1min, 弃废液；再次加入500ul漂洗液PW, 10000g 离心1min, 弃废液。再次离心2min。 8、将吸附柱CP3置于干净离心管, 向膜中央加入30ul洗脱 液EB, 室温放置1-2min。 10000g 离心2min,然后储于- 20冰箱中。 核酸定量 紫外吸收法 比尔-朗伯定律：OD = c 双链DNA： 1 OD260 50 ug/mL 单链DNA和RNA： 1 OD260 40 ug/mL 单链寡核苷酸： 1 OD260 33 ug/mL 双链DNA浓度C(mg/mL)=50ug/mL X OD260nm X 稀释倍数 优点：快速，不破坏样品 缺点：灵敏度低，要求样品较纯 OD260OD280：用于表示蛋白制品被核酸污染的程度 ，也可用来表示核酸被蛋白污染的程度，但核酸的 消光系数较高，只有存在较多的蛋白污染时才能反 应出来。 纯DNA： OD260:OD280 = 1.8-1.9 如果大于此值，说明有蛋白污染；如果小于此值说 明有RNA污染。 实验二: 质粒DNA的凝胶电泳 w 电泳：带电粒子在电场中移动的现象; w 在 pH 8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解 离，整个DNA分子带负电,在电泳时向正极移动,线 性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对 数值成反比。可以近似用于估算分子的大小. (一) 原理 w 琼脂糖介质结构均一，可通过调整琼脂糖的浓度改 变孔径的大小，起到分子筛的作用; w EB(溴化乙锭)或替代染料(GoldView)，加入胶中或 电泳后染色。 EB插入核酸碱基平 面，吸收紫外光 的能量产生荧光，荧光的强度与DNA的量 在一定范围内成正相关. 胶浓浓度（%）线线性DNA分离范围围（ kb) 0.35-60 0.61-20 0.70.8-10 0.90.5-7 1.20.4-6 1.50.2-4 2.00.1-3 胶浓浓度（ %） 溴酚蓝蓝二甲苯青 0.61kb 10.6kb2kb 1.40.2kb1.6kb 20.15kb (三) 凝胶分辨范围及指标剂的迁移 (三) 电泳检测步骤 安装模具:调整梳子与模具间距并封好两端. (2)制胶：称取琼脂糖1.0g，加入1TBE 100mL，于微 波炉中加热至完全溶解。冷却到约60，在凝胶中 加入2L的Goldviewer，混匀，倒胶。