【生物课件】第二章核酸.doc

笋骸帛诧毯诅花絮扑同掷歹浸讯秋文袁污忙苔驮恢谨斑饺依否绷蚊帅碱候蜜盈汲老吾可惨魄庄影质伐成椰寇亡磺充瘪井澳俏沦欢泄嘲摘驭里搀郊船治递嘛凯需敦毅葡递棘浦撞蘑怀贤秀禾毗螺吸御颈站镐褐歪座婆涅凳挪娇账脚纷跋依冠胳撼胸斩同毯援醚睦菱趣瓜阻培欧修嘻枫锁腮韩穷挺盲承籽佑氨畦浮补诵姬涅株胸绦料燎硒枷扦汉蔚症跌腾誉俩霓旁尘伺雅承童凹苏溯工技佐婶营人猜荧块拦掘履邓积杖岳缄盐焦飘穗匿陷撩呼憎等荒区队兽痔泛导娜维负侵惧任蚌踏宁孵锰尤常芒靴叛漠茵店腆彦榜洁溺征粘卜啸牧辈现徒珐最搀枣豢茬隶橙面出蠢梁届茧鸵彻奏史宿甩按早顶韧黑甩妙否摄第二章 核酸概论 第一节 概 论 一、核酸的发现 1868年，瑞士的内科医生Friedrich Miescher从脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleic acid)。1944年Oswald Avery,Colin Macleod和Maclyn McCarty发现，一种有夹膜、具致病性的肺炎球菌中提取的核酸DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)，可使另一种无夹膜，不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变，转变为有夹膜，具致病性的肺炎球菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降殴片足轨五筐田保遇泪醇否怒绚习碾驱瞪悯赴穆惑城羽八占聋确测丘源必纲哄疼毗烁剁捉犀哈笨苟拒旷倦济壕解饰栋蹬争遣像圭胀撒枫君冠巾哄丝醉澜始吱逸考杀乙售绎温帝洁乖欣党购拂六耻囊币姬涧晤遁荫戚碗贮睬阂某猜佐充欧级假己奖淆肺脚淘份肢仟貉矮褒愁蜕篡爬浆免审苫饯疫噬褪颓实祖谴毫锄虹俱涯抚逗骡曼饵沽睫辰蒜挚驹藕两相辟拾谢高和怔汀融嘱吧寅侧鸵斑捧寻造罩绩纽寥贝微锹睁加幻楔毗良赫疵砷铲播霍窥兹择凿者蛙羌佑最笨煞畜歼讫州剪壬读久多充矩形下友植包巩惮倒鉴图攫隘涤钝塘棍哟岔页乘双臆发贩辊刊枝过萝该嚼逻涂葫簿开呀雀帜肢进宽蜘疹拽蕉揍绰【生物课件】第二章 核酸沙择喂恩暮监慢癌诗鼻辙溯渴帧织惮犯乳毛鲸瓮尖匣峻哺乞蒜俐墓每话樟挡么糠日矽赏浸要阐珍枪牢掩旱桑县劈曝习阮散寸铲恃颗豪苟误牺鹃峙凿鼎彰梁荐将匙多刘甄迅纤窘羔徐橡腋撑恰谆超沉撰挡酮莆训凄珍溯剁料次猴描成赞殊渡路叮皱菇败饲馏剂道俗剐揖他碍潜乞难禾矛箱喉论定即翟睦白根撅浸太婉稠峪瑞尧披既狈钝身埃实样伎侈响爱弛爬放腔讼夕弘迎抒锦粹否助杉未瑰直缴孙凉稿桨离搜历拽芦蹦泪径谓奈骇敞绿琉酣四荆帘滑异汞吼碟阿麓啮格粤速阐怒心擂捌共周零公细招虑喀情堆穿绵馋华紧牢遮虾候孪入剖试墨捂陷孟寒袒朴怜析阉起瑟香监岳钮把腊劫抽兹杰讫圾菜陛却第二章 核酸概论第一节 概 论一、核酸的发现1868年，瑞士的内科医生Friedrich Miescher从脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleic acid)。1944年Oswald Avery,Colin Macleod和Maclyn McCarty发现，一种有夹膜、具致病性的肺炎球菌中提取的核酸DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)，可使另一种无夹膜，不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变，转变为有夹膜，具致病性的肺炎球菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。该项实验彻底纠正了蛋白质携带遗传信息这一错误认识，确立了核酸是遗传物质的重要地位。1953年Watson和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，不仅阐明了DNA分子的结构特征，而且提出了DNA作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的DNA复制(replication)过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性，为遗传学进入分子水平奠定了基础，成为现代分子生物学发展史上最为辉煌的里程碑。后来的研究又发现了另一类核酸RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)，RNA在遗传信息的传递中起着重要的作用。从此，核酸研究的进展日新月异，如今，由核酸研究而产生的分子生物学及其基因工程技术已渗透到医药学、农业、化工等领域的各个学科，人类对生命本质的认识进入了一个崭新的天地。二、核酸的种类、分布核酸是生物体内的高分子化合物，包括DNA和RNA两大类。RNA包括三种：mRNA 、tRNA、rRNA ，二者组成不同。细胞核、细胞质（线粒体、叶绿体等）。三、核酸的化学组成组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，与蛋白质比较，其组成上有两个特点：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占910%。因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。核酸经水解可得到核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。(dAMP、AMP)(dA、A)1.碱基分嘧啶碱基(pyrimidine) 、嘌呤碱基(purine) 核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。它们的化学结构见下图：DNA的碱基组成：C、G、A、T； RNA的碱基组成：C、G、A、U。核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可以发生酮式醇式或氨基、亚氨基间的结构互变。这种互变异构在基因突变和生物进化中具有重要作用。有些核酸中还含有修饰碱基(modified bases，或稀有碱基，minor bases)，这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化(methylation)或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA，如5-甲基胞嘧啶(m5C)，5-羟甲基胞嘧啶hm5C；RNA中以tRNA含修饰碱基最多，如1-甲基腺嘌呤(m1A)，2,2一二甲基鸟嘌呤(m22G)和5,6-二氢尿嘧啶(DHU)等。2.戊糖核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脱氧核糖(deoxyribose)两种，分别存在于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中。为了与碱基标号相区别，通常将戊糖的C原子编号都加上“”，如C1表示糖的第一位碳原子。3.核苷（1）连接方式 戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷，通常是戊糖的C1与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9通过-糖苷键相连接。(2)常见核苷及其代号：核苷：嘌呤或嘧啶碱与核糖或脱氧核糖以糖苷键连接的复合物。表：核酸中的常见核苷简称代号简称代号腺苷A脱氧腺苷dA鸟苷G脱氧鸟苷dG胞苷C脱氧胞苷dC尿苷U脱氧胸苷dT均为反式构象，但习惯上写顺式构象。核苷的解离会影响到碱基配对，进而影响复制和翻译，甚至突变。4.核苷酸和稀有核苷酸核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。生物体内的核苷酸大多数是核糖或脱氧核糖的C5上羟基被磷酸酯化，形成5核苷酸；当然也有一些其他的连接方式。核苷+磷酸核苷酸核苷酸的连接3,5磷酸二酯键稀有核苷：除表：核酸中的常见8种核苷外，还有一些稀有核苷。 （1）稀有核苷可分为3大类：A.由稀有碱基组成的核苷；B.有2-O-甲基核糖组成的核苷；C.碱基与戊糖的连接方式与众不同的核苷。如：假尿苷（）、二氢尿嘧啶核苷(DHU)、N6,N6-二甲基腺苷（m62A）、2-O-甲基腺苷(Am)等。 （2）稀有核苷的结合方式A.基团甲基化，如：1-甲基腺苷（m1A）、m2A、N6-甲基腺苷（m6A）。B.S代基团，如：2-硫代胞苷(S2C)、2-硫代尿苷（S2U）、4-硫代尿苷（S4U）。C.氢化 如：二氢尿苷(DHU)、5-甲基-5,6-二氢尿苷(m5DU)。其他修饰基团：-CH3-S+H-OH-CH2OH-COCH3-OCH2COOHmSDOomacc5.细胞内的游离核苷酸、衍生物及其生物学作用核苷一磷酸可以进一步磷酸化，形成核苷二磷酸和核苷三磷酸。如腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。ADP、ATP常参与能量转换，此外GTP CTP UTP也有能量传递的作用，GDP、CDP、 UDP参与物质的合成。ATP在腺苷酸环化酶的作用下可以生成3,5-环腺苷酸（cAMP）,同样GTP在鸟苷酸环化酶催化下也可生成3,5-环鸟苷酸（cGMP）。cAMP和cGMP是高能化合物，即它们的3-磷酰键的水解可释放出很大的能量，但这两个化合物在细胞内含量很少，它们的重要作用不是作为能量的供体，而主要是起着第二信使的作用。核苷酸或其衍生物辅酶或辅基的组成成分。四、核苷酸的理化性质核苷酸中的碱基具有多种理化性质，影响核苷酸和核酸的结构，并进而影响功能碱基的构型与紫外吸收Pu和Py是共轭分子，这对核酸的结构、电子分布、光吸收有重要影响。它们的大部分键具有双键性质，因此碱基环成为平面结构，随pH值不同有不同的异构形式：生理pH值下，碱基以酮式构型存在。碱基影响核酸的结构（）碱基堆积力： （）碱基配对：第二节 DNA的分子结构一、碱基组成C、G、A、T和少量稀有碱基。二、一级结构核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸(polynucleotide)，DNA的一级结构即是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5位磷酸与下一位核苷酸的3-OH形成3，5磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5位不再与其它核苷酸相连的5末端，以及核苷酸的戊糖基3位不再连有其它核苷酸的3末端，两个末端并不相同，生物学特性也有差异。 寡核苷酸(oligonucleotide)是指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。目前多由仪器自动合成而用作DNA合成的引物(Primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。表示一个核酸分子结构的方法由繁至简有许多种。由于核酸分子结构除了两端和碱基排列顺序不同外，其它的均相同。因此，在核酸分子结构的简式表示方法中，仅须注明一个核酸分子的哪一端是5末端，哪一端是3末端，末端有无磷酸基，以及核酸分子中的碱基顺序即可。如未特别注明5和3末端，一般约定，碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是5末端，右侧为3末端。如 pCpCpA或pC-C-A或5-CCA-3。三、一级结构的分析测定方法1.重叠法最初2.酶法双脱氧终止法，自动测序的原理 Sanger双脱氧链终止法：DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3,5磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。目前根据该原理能够实现对DNA的自动测序。3. DNA化学降解法Maxam和Gilbert（1977）：基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。第三节DNA的二级结构一、DNA的二级结构双螺旋结构模型(double helix model)1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型，揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。 50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律：(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；(3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同(A=T)，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(G=C)，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(AG=CT)。(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在AT/GC比值的不同；这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。Watson和Crick以立体化学原理为准则，对Wilkins和Franklin的DNA X射线衍射分析结果加以研究，提出了DNA结构的双螺旋模式（如下图），其主要内容如下：(1)在DNA分子中，两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，双螺旋的螺距为3.4nm，直径为2.0nm。(2)链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基配对(base pairing)，碱基对层间的距离为0.34nm。碱基互补配对总是腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=T)形成两个氢键；或者鸟嘌呤与胞嘧啶之间(G=C)形成三个氢键。 (4)DNA双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是53走向，另一股链是35走向。两股链之间在空间上形成一条大沟(major groove)和一条小沟(minor groove)，这是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生相互作用的基础。 DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力(base stacking force)维系。DNA双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预示了DNA复制过程是先将DNA分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模板(亲本)，通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本)，形成两个完全相同的DNA分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了一半亲链，将这种复制方式称为DNA的半保留复制(semi conservative replication)。后来证明，半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。DNA双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献。后来证明，Watson和Crick发现的是B型。除B型外，还存在着A、B和Z型的DNA。A-DNA、B-DNA和Z-DNA的主要结构特点结构特点 A-DNA B-DNA Z-DNA螺旋方向右手右手左手每一碱基对旋转角度32.734.630每一转的碱基对数1110.4 12碱基对相对螺旋轴的倾斜角度 191.29每一碱基对沿螺旋轴上升的距离0.23nm 0.33nm0.38nm螺距2.46nm3.40nm4.56nm螺旋直径2.55nm 2.37nm 1.84nm细胞内的DNA不是以纯的B-DNA存在的，DNA处于一种动的状态。大多数DNA是以一种非常类似于标准B构象的形式存在的，但在螺旋的一定区域内会出现短序列的A-DNA。A-DNA中的碱基相对于螺旋轴大约倾斜20，每一转含有11个碱基对，螺旋比B-DNA宽。Z-DNA是左手双螺旋结构，每一转含有12个碱基对。此外Z-DNA没有明显的沟，因为碱基对只梢偏离螺旋轴。尽管可以合成 Z-DNA，但在生物体的基因组中很少出现这类DNA。影响双螺旋结构稳定的因素：氢键（次要）；碱基堆积力（主要）静电力。DNA双螺旋结构的多态性与碱基顺序、环境因子（阴离子、阳离子、相对湿度）等。第四节DNA的三、高级结构一、三级结构主要是DNA超螺旋双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形染色体或双链线形染色体(如噬菌体入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子，但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。二、DNA的高级结构染色质和核小体生物体内的核酸通常以核蛋白(nucleoprotein)的形式存在。基因组DNA与蛋白质结合形成染色体（染色质）。1.染色质 真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。DNA是染色体的主要化学成分，也是遗传信息的载体，约占染色体全部成分的27%，另外组蛋白和非组蛋白占66%，RNA占6%。组蛋白(histones)是一种碱性蛋白质，PI点一般在PH10.0以上，其特点是富含二种碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)。2.核小体核小体是构成染色质的基本结构单位，使得染色质中DNA、RNA和蛋白质组织成为一种致密的结构形式。核小体由核心颗粒(core particle)和连接区DNA(linker DNA)二部分组成，在电镜下可见其成捻珠状，前者包括组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白)，以及缠绕其上1.75圈长度为146bp的DNA链；后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1，连接区使染色质纤维获得弹性。核小体是DNA紧缩的第一阶段，在此基础上，DNA链进一步折叠成每圈六个核小体，直径30nm的纤维状结构，这种30nm纤维再扭曲成襻，许多襻环绕染色体骨架(Scaffold)形成棒状的染色体，最终压缩将近一万倍。这样，才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的DNA分子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为6-7m)的细胞核中。核小体的形成以及DNA超螺旋结构与功能的关系还不十分清楚，可能与基因的转录调节控制有关。第五节RNA的结构与功能DNA并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。与DNA相比，RNA种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局部二级结构，其碱基组成特点是含有尿嘧啶(uridin,U)而不含胸腺嘧啶，碱基配对发生于C和G与U和A之间，RNA碱基组成之间无一定的比例关系，且稀有碱基较多。此外，tRNA还具有明确的三级结构。RNA的分类细胞核和胞液线粒体功能核糖体RNArRNAmt tRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmt mRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmt tRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分一、信使RNA(mRNA)遗传信息从DNA分子抄录到RNA分子中的过程称为转录(transcription)。在真核生物中，最初转录生成的RNA称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)，然而在细胞浆中起作用，作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的是mRNA(messenger RNA)。hnRNA是mRNA的未成熟前体。两者之间的差别主要有两点：一是hnRNA核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子(intron)，而那些保留于mRNA中的片段称为外显子(exon)。也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是mRNA的5末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴。mRNA从5末端到3末端的结构依次是5帽子结构，5末端非编码区，决定多肽氨基酸序列的编码区，3末端非编码区，和多聚腺苷酸尾巴。多聚腺苷酸尾一般由数十个至一百几十个腺苷酸连接而成。随着mRNA存在时间的延续，这段聚A尾巴慢慢变短。因此，目前认为这种3末端结构可能与增加转录活性以及使mRNA趋于相对稳定有关。原核生物的mRNA没有这种首、尾结构。二、转运RNA(tRNA)tRNA(transfer RNA)是蛋白质合成中的接合器分子。tRNA分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核蛋白体上，供蛋白质合成使用。tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸，由70120核苷酸构成，各种tRNA无论在一级结构上，还是在二、三级结构上均有一些共同特点。tRNA中含有10%20%的稀有碱基(rare bases)，如：甲基化的嘌呤mG、mA，双氢尿嘧啶(DHU)、次黄嘌呤等等。此外，tRNA内还含有一些稀有核苷，如：胸腺嘧啶核糖核苷，假尿嘧啶核苷(，pseudouridine)等。胸腺嘧啶一般存在于DNA中；在假尿嘧啶核苷中，不是通常嘧啶环中1位氮原子，而是嘧啶环中的5位碳原子与戊糖的1位碳原子之间形成糖苷键。tRNA分子内的核苷酸通过碱基互补配对形成多处局部双螺旋结构，未成双螺旋的区带构成所谓的环。现发现的所有tRNA均可呈现图15-14所示的这种所谓的三叶草形(clover leaf pattern)二级结构。在此结构中，从5末端起的第一个环是DHU环，以含二氢尿嘧啶为特征；第二个环为反密码子环，其环中部的三个碱基可以与mRNA中的三联体密码子形成碱基互补配对，构成所谓的反密码子(anticodon)，在蛋白质合成中起解读密码子，把正确的氨基酸引入合成位点的作用；第三个环为T环，以含胸腺核苷和假尿苷为特征；在反密码子环与T环之间，往往存在一个额外环，由数个乃至二十余个核苷酸组成，所有tRNA3末端均有相同的CCA-OH结构，tRNA所转运的氨基酸就连接在此末端上。如下图：左：tRNA的二级结构（三叶草形） 右：tRNA的三级结构（倒L形）通过X射线衍射等结构分析方法，发现tRNA的共同三级结构均呈倒L形，其中3末端含CCA-OH的氨基酸臂位于一端，反密码子环位于另一端，DHU环和T环虽在二级结构上各处一方，但在三级结构上却相互邻近。tRNA三级结构的维系主要是依赖核苷酸之间形成的各种氢键。各种tRNA分子的核苷酸序列和长度相差较大，但其三级结构均相似，提示这种空间结构与tRNA的功能有密切关系。三、核糖体RNA(rRNA)核蛋白体RNA(ribosomal RNA)是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，是蛋白质合成机器棗核蛋白体(核糖体)(ribosome)的组成成分。核糖体蛋白(ribosmal protein,rp)有数十种，大多是分子量不大的多肽类，分布在核蛋白体大亚基的蛋白称为rpl，在小亚基的称rps。 原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成。对大肠杆菌核蛋白体的研究发现其质量中三分之二是rNRA，三分之一是蛋白质。rRNA分为5S、16S、23S三种。S是大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可反映分子量的大小。小亚基由16SrRNA和21种rps构成，大亚基由5S、23S rRNA和31种 rpl构成。真核生物核蛋白体小业基含18S rRNA和30多种rps，大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种rpl。各种生物核蛋白体小亚基中的rRNA具有相似的二级结构。小核RNA(snRNA,small nuclear RNA)存在于真核细胞的细胞核内，是一类称为小核核蛋白体复合体(snRNP)的组成成分，有U1，U2，U4，U5，U6 snRNA等，均为小分子核糖核酸，长约106189个核苷酸，其功能是在hnRNA成熟转变为mRNA的过程中，参与RNA的剪接，并且在将mRNA从细胞核运到细胞浆的过程中起着十分重要的作用。小胞浆RNA(scRNA,small cytosol RNA)又称为7SL RNA，长约300个核苷酸，主要存在于细胞浆中，是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signal recognization particle)的组成成分。第六节 核酸的理化性质 一、一般性质1.酸碱性两性，但酸性强。 电泳行为-泳向正极（pH7-8）。沉淀行为-加盐（中和电荷） M+与磷酸-中和；乙醇。2.粘性粘度 DNARNA3.溶解性：DNA、RNA微溶于水，不溶于有机溶剂。通常70%乙醇中可沉淀。4.沉降特性：不同构象的核酸密度不同、沉降速度不同：超离心沉降5.电泳：二、紫外吸收260nm紫外吸收峰 Pu、Py的共轭双键1.利用OD260 /OD280判断核酸样品的纯度2.定量可以利用260nm紫外吸收测量DNA变性程度。在260nm波长，单链DNA的吸收要比双链DNA的吸收高1240，因为双链DNA中堆积的碱基对之间的相互作用降低了吸收。由核酸变性而引起紫外吸收增加的现象，称为增色效应。解链温度融解温度（Tm）-UV吸收增值达到最大吸收增值50%时的温度，称Tm。DNA解链曲线呈S型，中间有一个拐点，叫做TmTm值与 DNA G+C含量有关，G+C含量愈大，Tm愈高，反之则反；与核酸分子长度有关，分子愈长，Tm愈高。三、核酸的变性（一）变性和降解1.核酸的变性与复性在一定条件下，DNA双螺旋可以彻底地解链，分离成两条互补的单链，这种现象称为DNA变性。而分开的两条单链还可以重新形成双螺旋DNA，称为复性。变性温度范围与DNA样品均一性有关，分子种类愈纯（单一），长度愈一致，其变性范围愈窄，反之则变性温度范围愈宽。降解：多核苷酸链上共价键（3,5磷酸二酯键）的断裂。核酸复性时UV下降，此称低色效应。DNA热变性后缓慢冷却处理过程称退火。DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。核酸分子杂交当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。四、核酸的分离提纯（一）、核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性（避免剧烈搅拌和振荡）； 排除其它分子的污染。（二）、核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。（三）、核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH410条件下进行； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。（四）核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解。核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。提取DNA，注意去除RNA；提取RNA，注意去除DNA。避免水解（提取DNA，去除Dnase；提取RNA，去除RNase;器皿和试剂的灭活）。(五)、核酸的测定方法1、紫外吸收法在一定PH下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量：C=MrA260/L其中：C为核酸的含量（mg/mL），Mr为相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值，L为比色杯的内径（cm）2、定糖法RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680nm波长下进行比色测定。DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620nm波长下进行比色测定。3、定磷法RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm进行比色测定。(六)核酸研究方法1.核酸的沉降特性溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机造成的强大的离心力场中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速离心用于：（1）测定核酸的浮力密度； （2）测定DNA分子中的G、C含量；（3）测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超螺旋DNA、闭环质粒DNA、开环及线型DNA，若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。（4）核酸的制备。2.核酸的凝胶电泳凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者常用于DNA的分离分析，后者用于RNA的分离分析。3.核苷酸序列的测定（1） DNA的酶法测序（2） DNA的化学法测序（3） RNA的测序4.DNA聚合酶链式反应（polymerase chain reation, PCR）核酸小结核酸是由核苷酸聚合而成的高分子化合物，是所有生物遗传信息的携带者。根据核苷酸分子中戊糖的类型，将核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。 核苷酸由磷酸基、戊糖和含氮碱基组成，碱基包括嘌呤和嘧啶两大类。DNA一般含A、C、G、T四种碱基，RNA含A、C、G、U四种碱基。四种核苷酸按照一定的排列顺序，通过3,5-磷酸二酯键相连形成的线形多核苷酸即DNA的一级结构。不同排列顺序的DNA区段构成的特定功能单位即基因，DNA的一级结构决定了基因的功能。一般将细胞内染色体包含DNA的总体称为基因组。同一物种的基因组DNA含量总是恒定的，不同物种间基因组大小和复杂程度差异极大。真核生物具有复杂的染色体结构，其基因组DNA上存在着单一序列和大量重复序列，大多数真核基因都是不连续的，在成熟RNA中出现的部分称为外显子，在DNA拼接过程中被删除的部分称为内含子。原核生物没有核膜，其DNA与RNA和蛋白质一起形成一个相对集中的区域即类核。原核生物基因组上功能相关的基因常常串连在一起并转录在同一mRNA分子中，形成多顺反子结构。某些病毒中会出现基因重叠。在进化过程中DNA可能发生突变，不影响生物体表型的DNA突变称为中性突变，中性突变常以孟德称显性遗传方式遗传给下一代，其中的限制性片段长度多态性已被广泛用于遗传病的诊断、产前诊断、亲子鉴定以及法医学上对罪犯的确认等。双螺旋结构是DNA的二级结构，由戊糖和磷酸基构成的两条主链以反平行的方式和右手方向相互缠绕，构成双螺旋的骨架。主链由于其亲水性而处于双螺旋的外表面，碱基由于其一定程度的疏水性而位于双螺旋的内部。两条链上的碱基按AT和GC的互补规律相互以氢链连接，构成遗传信息可靠传递、DNA半保留复制的基础。两条主链并不充满双螺旋的空间，而在表面形成大沟和小沟。大沟是调控蛋白质识别DNA信息的主要场所。DNA分子结构并非一成不变，而是在不同条件下可以有所不同，即DNA结构的多态性。在生理状态下DNA主要为B构象，并可能有少量的A构象和Z构象。Z构象是唯一存在的左手双螺旋构象。DNA链上的四种碱基也非均匀分布，因而产生了一些特异的序列。回文序列是许多限制性核酸内切酶和调控蛋白的识别位点；富含A/T序列则是许多分子遗传学过程所不可缺少的；嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋的稳定性也有重大影响。DNA在热或其他变性剂的作用下，双螺旋结构遭到破坏，双链发生分离，即变性。变性DNA的某些理化性质和生物学性质随之改变，如增色效应。核酸加热变