[理学]组织型纤溶酶原激活剂论文：组织型纤溶酶原激活剂极低密度脂蛋白Y成纤维细胞减毒鼠伤寒沙门氏菌卵黄.doc

组织型纤溶酶原激活剂论文：荧光蛋白标记的t-PA EGF缺失基因在鸡体内定位表达及靶向转运【中文摘要】人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator, t-PA)在临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗。由于t-PA溶栓作用强而又不引起全身性纤溶所导致的弥漫性出血,是目前防治血栓性疾病最为理想的药物。apo-B100是极低密度脂蛋白Y(very low density lipoprotein,VLDLy)组装和分泌所必需的载脂蛋白,也是VLDLy通过受体介导的内吞作用进入卵母细胞的配体,VLDLy以完整的脂蛋白颗粒通过卵母细胞膜上的凹陷小泡以内吞的形式进入生长中的卵泡,实现在卵黄中的沉积。为探索t-PA在鸡卵黄中定向积淀的可行性,开发具有抗心血管疾病的功能性鸡蛋,本研究将t-PA功能区基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因进行融合,利用绿色荧光蛋白的灵敏度高、便于检测的特性,构建荧光蛋白融合基因表达载体,电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌crp SL1344,静脉注射转染初产蛋鸡,对融合基因在鸡体内表达及表达产物在卵黄的沉积进行定性、定量以及活性检测,为减毒沙门氏菌介导基因转移和利用家禽作为生物反应器生产t-PA功能蛋白的研究奠定基础。本研究应用分子生物学.【英文摘要】Human tissue-type plasminogen activator(t-PA) is widely used in clinical treatment of cardiovascular diseases. T-PA is an effective thrombolytic without causing diffuse bleeding because of systemic fibrinolysis, it was the ideal drug to prevention and treatment of thrombosis. Apolipoprotein (apo-B100) is a necessary factor for the formation and assembles of very low density lipoprotein Y (VLDLy). During the course of biomacromolecules deposition in yolk, VLDLy was swallowed into growth yolk oocytes in the f.【关键词】组织型纤溶酶原激活剂 极低密度脂蛋白Y 成纤维细胞 减毒鼠伤寒沙门氏菌 卵黄【英文关键词】Human tissue-type plasminogen activator very low density lipoprotein Y fibrocyte cells attenuated Salmonella typhimurium Yolk【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848【目录】荧光蛋白标记的t-PA EGF缺失基因在鸡体内定位表达及靶向转运摘要2-4ABSTRACT4-5第1章 文献综述9-231.1 t-PA 的研究进展9-111.1.1 t-PA 发展简史9-101.1.2 t-PA 的生物学活性10-111.1.3 t-PA 的功能及应用111.2 产蛋鸡卵黄中营养物的转运与沉积的研究11-121.2.1 apo-B100 对VLDLy 组装过程的影响11-121.2.2 VLDLy 在卵黄中沉积的过程121.3 绿色荧光蛋白的研究进展12-151.3.1 绿色荧光蛋白的特点131.3.2 绿色荧光蛋白的应用13-151.4 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展15-171.4.1 沙门氏菌的侵入途径15-161.4.2 减毒沙门氏菌的研究161.4.3 减毒沙门氏菌作为活载体的研究16-171.5 转基因家禽生物反应器的研究进展17-201.5.1 家禽的生理特点17-181.5.2 家禽作为生物反应器的独特优势181.5.3 常规转基因动物技术在家禽转基因应用中的局限性18-201.6 利用转基因动物生物反应器生产t-PA20-221.6.1 t-PA 在原核和真核细胞中的表达201.6.2 t-PA 在转基因动物乳腺中的表达20-211.6.3 t-PA 的纯化和检测21-221.7 问题与展望22-23第2章 真核表达质粒pEGFP-N1-apo-tPA 的构建及鉴定23-332.1 材料23-252.1.1 主要试剂23-242.1.2 主要溶液及配制方法24-252.1.3 主要仪器设备252.1.4 DNA 分析软件252.2 试验方法25-302.2.1 基础载体和表达载体252.2.2 构建pEGFP-N1-apo-tPA 表达载体25-262.2.3 引物设计与合成262.2.4 apo-tPA 蛋白基因的扩增、回收纯化、克隆26-272.2.5 连接产物的转化、质粒提取及鉴定27-292.2.6 Apo-tPA 基因融合与pEGFP-N_1-apo-tPA 表达载体构建29-302.3 结果与分析30-322.3.1 目的基因的克隆302.3.2 pMD18-T-apo-tPA 质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定30-312.3.3 pEGFP-N_1-apo-tPA 质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定31-322.4 讨论32-33第3章 pEGFP-N_1-apo-tPA 质粒在鸡胚成纤维细胞中的表达33-413.1 材料与试剂33-353.1.1 主要试验材料333.1.2 主要试剂33-343.1.3 主要溶液及配置方法34-353.2 试验方法35-373.2.1 鸡胚成纤维细胞的分离和体外培养353.2.2 pEGFP-N_1-apo-tPA 质粒对成纤维细胞的转染353.2.3 鸡胚成纤维细胞中表达产物的定性检测35-363.2.4 鸡胚成纤维细胞中表达产物的ELISA 检测363.2.5 鸡胚成纤维细胞中表达产物的体外活性检测36-373.3 结果与分析37-393.3.1 鸡胚成纤维细胞的体外培养373.3.2 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测37-383.3.3 成纤维细胞中表达产物的荧光镜检383.3.4 成纤维细胞中表达产物的ELISA 检测38-393.3.5 鸡胚成纤维细胞中表达产物的活性检测393.4 讨论39-41第4章 减毒鼠伤寒沙门氏菌crp SL1344 作为活载体的研究41-494.1 材料与试剂41-424.1.1 材料41-424.1.2 主要培养基及抗生素的配制424.2 试验方法42-434.2.1 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌crp SL1344 (pEGFP-N_1-apo-tPA)的构建42-434.2.2 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的稳定性434.2.3 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的转染434.2.4 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌分布检测434.2.5 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究434.3 结果与分析43-474.3.1 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌crp SL1344(pEGFP-N_1-apo-tPA)构建及鉴定43-454.3.2 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的稳定性454.3.3 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌分布检测45-464.3.4 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究46-474.4 讨论47-49第5章 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌crp SL1344 (pEGFP-N1-apo-tPA)鸡体内表达及卵黄中沉积49-575.1 试验材料505.1.1 材料505.1.2 主要器械及仪器505.1.3 主要溶液及配制方法505.2 试验方法50-525.2.1 减毒鼠伤寒沙门氏菌介导法50-515.2.2 融合蛋白在鸡蛋中的定性表达检测515.2.3 融合蛋白在鸡蛋中的定量检测51-525.2.4 融合蛋白在卵黄中的活性表达检测5