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酵母毕业论文 1 酵母多糖提取工艺毕业论文酵母多糖提取工艺毕业论文 摘 要 本实验采用的 是 CICC 编号 31229 的 红酵母，通过对红酵母的实验，了解红酵 母的特性及生长特点，进而改善红酵母的培养条件及培养基来扩大红酵母的生长浓度。 研究从红酵母中提取酵母多糖的提取工艺，确定酵母多糖提取方法。 采用摇瓶培养的方法，通过碳源、氮源及主要营养与环境条件等对红酵母产菌量 的影响试验，以及葡萄糖、蛋白胨、酵母膏三因素三水平的正交试验，获得了红酵母 的最佳生长条件：葡萄糖 2，蛋白胨 10，酵母膏 0,5，磷酸二氢钾 015，硫酸镁 001，氯化钠 10，初始 pH50，接种量 10，500mL 三角 瓶中培养基装量为 80mL，发酵温度为 28，摇床 200rmin。在此优化的培养条件下， 海洋红酵母的产菌量可达 97 亿个mL，比优化前发酵培养基产菌量（56 亿个 mL）提高了 732，比单因素试验结果（81 亿个mL）提高了 198。 研究从酵母中提取胞壁多糖的提取工艺。提取工艺路线为：酵母溶解冻融一超 声波破碎一碱溶一中和一沉淀一洗涤烘干。通过正交试验对酵母破壁和碱溶条件进 行优化。初步寻求提取工艺条件，多糖得率为 194，用苯酚一硫酸法测定多糖的 含量为 519。 关键词关键词: :红酵母 高细胞密度 培养条件优化 酵母多糖 提取工艺 酵母毕业论文 2 Abstract The experiment was through the study of the Rhodotorula glutinis，to understand the characteristics and growth characteristics of Rhodotorula glutinis, Thereby improving conditions for the cultivation of red yeast and the medium to expand the growth of red yeast concentration. A flask of training methods，The use of Rhodotorula glutinis，Through the carbon source, the nitrogen source and the main nutrition and the environmental condition and so on produce the fungus quantity to the Rhodotorula glutinis benthica the influence experiment, as well as the sucrose, the protein peptone, the yeast paste three factors three levels orthogonal experiments, we have obtained the Rhodotorulas best fermentation condition：sucrose 1.5 %, protein peptone 1.0 %, yeast paste 0.5 %, potassium dihydrogen phosphate 0.15 %, magnesium sulfate 0.01%, sodium chloride 1.0 %, initial pH 5.0, inoculating quantity 8 %, 80 mL medium in the 500 mL triangle bottle, temperature 28, 200 revolutions/minute. Under this optimized condition, the number of Rhodotorula has reached 970 million / mL, which enhanced 73.2 % to the initial conditi（560million/mL） and improved 19.8 % to the result of the test of the single factor （810 million/mL）. This experiment is studying on the craft of polysaccharides extraction from rhodotorul cell-wal1The craft route drawn：yeast dissolvefreeze thawinguhrasoinc crush alkali abstractionneutralizedepositsolvent washdrySeek the best craft condition，as well as optimize conditions ofcrush wall and alkali dissolving by orthogonal experimentyield of polysaccharide is 19.4 Determination with phenolsulphuric aicd lawcontent of polysaccharide is 51.9 Key words:Rhodotorula ; High cell density; Raise condition optimization；yeast polysaccharid；extracting craft 酵母毕业论文 3 第一章 绪论 1.1红酵母及酵母多糖 红酵母是半知菌亚门、芽孢纲、隐球酵母科真菌中的一属。细胞球形、卵形或香 肠形，有的形成荚膜。一般不形成假菌丝和真菌丝，多边芽殖，不产子囊孢子或掷孢 子。菌落红色、粉红色橙色或黄色，圆形，边缘整齐，质黏。严格好氧呼吸。能同化 某些糖类，无乙醇发酵能力。不能以肌醇为惟一碳源，多数同化硝酸盐，一般不液化 明胶。菌体含大量脂肪，可提取应用。有的种对正癸烷、正十六烷及石油有弱氧化作 用，并能合成 -胡萝卜素。分布较广，植物体、饮料、泡菜汁、海水、淡水和空气 中常有。如黏红酵母(R.glutinis)和深红酵母(R.rubra)等。 红酵母菌没有酒精发酵的能力，少数种类为致病菌，在空气中时常发现。有的菌， 如粘红酵母，能产生脂肪，其脂肪含量可达干物质量的 50%-60%。但合成脂肪的速 度较慢，如培养液中添加氮和磷，可加快其合成脂肪的速度。产 1g 脂肪大约需 4.5g 葡萄糖。此外,粘红酵母还可产生丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多种氨基酸。 由糖苷键结合的糖链，至少要超过 10 个以上的单糖组成的聚合糖才称为多糖。 比 10 个少的短链的称为寡糖。不过，就糖链而论即使是寡糖，在寡糖上结合了蛋白 质和脂类的，就整个分子而论，如果是属于高分子，则从广义上来看也属于多糖，因 此特称为复合多糖或复合糖质（糖蛋白、糖脂类、蛋白多糖） 。多糖无甜味，在水中 不能形成真溶液，只能形成胶体，无还原性，无变旋性，但有旋光性。细胞膜和细胞 壁的多糖成份不仅是支持物质，而且还直接参与细胞的分裂过程，在许多情况下成为 细胞和细胞，细胞和病毒，细胞和抗体等相互识别结构的活性部位。 酵母多糖是酵母细胞壁的重要组成部分，其主要成分为大分子的甘露聚糖及糖蛋 白复合物，酵母多糖占酵母细胞壁干重的 40左右。酵母多糖具有多种重要生物活性， 如增强免疫功能、抗病毒、抑制肿瘤生长等 。 1.2 红酵母的相关产品及应用及应用 1.2.1 红酵母相关产品 红酵母不仅含有丰富的蛋白质、维生素，不饱和脂肪酸，而且还能产生类胡萝卜 素（具有能吸收光、淬灭单线态氧和三线态致敏剂；能代谢为视黄酸、组织和血浆的 抗氧化剂、参与繁殖和生育、可增强动物免疫功能、可作为抗癌剂和抗衰老剂、可赋 予动物肌肉特殊颜色等特点）如虾青素等天然物质。 （1）虾青素 虾青素为脂溶性的艳丽红色色素，能赋予动物肌肉特殊颜色，具有很强的抗氧化 和清除氧自由基的能力（即使在经小肠整体吸收后，仍具有极强的抗氧化能力），而 且在促进抗体产生、增强动物免疫功能、淬灭自由基能力等方面均强于众所周知的 - 酵母毕业论文 4 胡萝卜素。虾青素抗脂氧化的能力比 胡萝卜素强 10 倍，比维生素 E 强 100 倍。 在虾青素分子中，有很长的共轭双键，有羟基和在共轭双键链末端的不饱和酮， 其中羟基和酮基又构成 羟基酮。这些结构都具有比较活泼的电子效应，能向自由 基提供电子或吸引自由基的未配对电子。可见虾青素的结构特点使其极易与自由基反 应而清除自由基，发挥其抗氧化作用。 目前，世界上仅有 3-4 家外国大公司能够生产虾青素。国内尚无生产该产品的大 型厂家。在国内市场上销售的产品全部为进口产品，国内对该产品的需求量很大。一 些研究者的研究结果证明了虾青素具有许多奇异的生物学功能，诸如能抑制多元不饱 和脂肪酸的氧化、能抵御紫外线的伤害、具有维生素 A 的活性、改善视力、增强免疫 力、调控色素形成和神经连通以及改善生育等。根据虾青素的上述特性，可以在许多 方面发挥其功能，尤其是在如下几个方面具有广阔的应用前景：水产品添加剂、畜禽 饲料添加剂等。 产品特点 1.促进个体生长，提高繁殖能力：由于红酵母菌体中富含蛋白质、肝糖、高级不饱和 脂肪酸、虾青素、天然生长激素等物质，因此能有效地促进个体生长；提高动物的受 精率，减少胚胎的死亡率，增强繁殖能力。 2.增强动物的免疫力：由于红酵母菌体中含有的虾青素在抗氧化、消除自由基方面的 功能均优于 胡萝卜素，可以促进抗体的产生、增强动物的免疫功能。 3.增加营养价值：虾青素积累在虾、蟹、鱼体内呈红色，不仅使水产品更富有营养、 色泽更为鲜艳、味道更为鲜美，食用这些水产品对消费者的健康更为有利。 4.促消化吸收因子：产品中含有酵母及酵母生长中产生的多种消化酶类、生长因子， 可以有效地促进各种水产动物的消化吸收，提高其对饲料的消化利用率。 5.纯天然酵母类添加剂：不会导致水产动物产生耐受性，正常使用无任何副作用。 应用范围： 1. 虾、蟹、贝、参、鲍鱼育苗。 2. 虾、蟹、鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、鰤鱼、虹鳟鱼、真鲷及观赏鱼类的喂养。 3. 轮虫养殖及营养强化。 4. 家禽、家畜的喂养。 （2）不饱和脂肪酸 多价不饱和脂肪酸一般是指分子中含两上或两个以上的双键、碳链长度在十八或 十八个碳原子以上的脂肪酸，它们是功能性脂肪酸研究和开发的主体与核心，根据其 结构又派分出 -3 和 -6 两大系列的亚油酸和 -3 系列的 -亚麻酸，是人体不可或缺 的必需脂肪酸，更重要的是因为可以由它们在体内代谢转化为 DHA、EPA 等，对人 体生理中起着极为重要的作用的物质。脂肪是鱼类活动能量的主要来源，且能提高蛋 白的利用效率，-3 不饱和脂肪酸是鱼类生长的必需脂肪酸，还能帮助脂溶性维生素 A、D、E、K 的吸收。EPA 和 DHA 对动物的脑神经组织发育的活动具有重要的作用， 酵母毕业论文 5 能促进动物正常发育和生长，真鲷仔稚鱼的生长发育过程中对饵料的营养价值要求较 高，而轮虫、卤虫无节幼体内所含的高度不饱和脂肪酸(HUFA)较低，特别是 EPA 和 DH 的含量不足，常造成育苗成活率低，畸形率高。研究工作表明，向家禽饲料中补 加不饱和脂肪酸，更易于被动物吸收利用，可改善其生产性能。 （3）胡萝卜素 胡萝卜素作为食品添加剂和营养增补剂,其优良品质和功效,早已为世界各国所公 认,目前已广泛应用于医药、食品及饲料添加剂。胡萝卜素不仅色泽鲜艳,而且作为VA 的前体更富有营养。另外胡萝卜素具有抗氧化性对超氧阴离子、羟基自由基具有一定 的抑制清除作用。特别是近年来报道-胡萝卜素具有软化血管等保健功能,受到了各 国科学家们的高度重视,在国际市场上的需求量也日益增大。 当前生产- 胡萝卜素的方法有化学合成和生物方法两种。随着毒理学和分析技 术的不断发展,合成色素的毒性问题越来越受到人们的关注,国外许多国家限制合成色 素使用。利用生物方法制取天然的-胡萝卜素有2种方式:用培养盐藻来提取-胡 萝卜素,因需高盐分的水域环境,只能在少数地区养殖,生产有很大的局限性; 微生 物发酵法生产-胡萝卜素,利用红酵母产胡萝卜素。该法有以下的优点: 菌体无毒, 并含有丰富的蛋白质和维生素;可利用蔗渣、废糖蜜等进行培养,成本较低、周期短、 发酵控制容易,有利于工业化生产;可不用提取色素,整个细胞作为含胡萝卜素的单细 胞蛋白,用作饲料添加剂或水产养殖用饵料。目前,国际上-胡萝卜素的年需求量在1 500t以上,国内年需求量约600t,年销售额为2.5亿3亿美元,且每年以7%10%的速度 递增。我国-胡萝卜素的市场价约1.1万元/kg,天然胡萝卜素的市场价约为1.8万元 /kg。国际上天然-胡萝卜素的价格是合成-胡萝卜素的2倍左右,但天然-胡萝卜 素只占-胡萝卜素的5%6%,天然胡萝卜素的发展空间巨大。因此,研究红酵母生产 胡萝卜素具有一定的应用价值和开发前景。 （4）油脂 我们平常吃的油脂不是由芝麻、花生和油菜子等油料作物榨取的植物油脂，就是 由猪、牛及羊等动物的熬制动物油脂，很少考虑到微生物油脂，其实，在许多微生物 中都含有油脂，低的含油率 23，高的竟达 6070，因此，利用微生物来 生产食用油脂是广开“油路” ，造福人类的一条新途径。 不同种类的微生物油脂含量 差异很大，一种称作油藻的淡水单细胞藻类含油量达干重的 2040，休眠状态含 量更高，可达 80以上。细菌中大肠杆菌为 199，霉菌中的青霉为 3540， 酵母中的圆形酵母为 50，而细长红酵母高达 6174，油脂系数 20 60。居酵 母菌群之首，而且其营养要求不高，用不加任何营养物质的稻草水解液或农副产品加 工后的废料培养 34 天，即可获得高油脂含量的菌体。用红酵母发酵大量生产，可 不受季节和自然环境条件的影响，生产周期短，产量高，是动物及所有油科植物不能 比拟的。 （5）L-苯丙氨酸 酵母毕业论文 6 L-苯丙氨酸(L-Phe)作为8种人体必需的氨基酸之一,很早就受到人们的重视。随 着新型甜味剂天冬甜二肽(APM)( 阿斯巴甜) 的出现,作为APM重要原料之一的苯丙氨 酸的需求量就会不断增加。近年来发现苯丙氨酸又是一些抗癌药物的中间体,这就更 加提高了人们对它的兴趣。2000年度,全球阿斯巴甜的消费量已达20000t,而我国对阿 斯巴甜的消费基本依赖进口。L-苯丙氨酸的生产成为我国发展自身阿斯巴甜产业的瓶 颈。国家急需开发L-苯丙氨酸生产的生物技术,“七五”、“八五”和“九五”计划 一直将其列为科技攻关项目。利用苯丙氨酸解氨酶(PAL)由肉桂酸和氨合成L-苯丙氨 酸是生产苯丙氨酸的一条重要途径,但由于APM的不稳定,很大程度上制约了该工艺的 发展。因此,在生产工艺较为成熟时,高活性、高稳定性的PAL酶源菌株的筛选和培育 尤其显得重要。粘红酵母就是一种高PAL活性的菌种,在实验中L-Phe累计产量达 58.0mg/mL,有生物技术应用价值。利用红酵母生产L-苯丙氨酸前景良好。 1.2.2 红酵母的应用 红酵母是从海洋泥中分离出来的单细胞真核生物,主要用于海产品的育苗和养殖。 该产品能显著提高幼苗的存活率、提高饲养效果和饲料报酬率并能增强动物体的免疫 功能、减少抗生素用量,是生态养殖的优良添加剂。投喂饲料中添加红酵母的水产品 具有抗病能力强, 存活率高, 皮肤和肌肉色泽鲜艳,口味好等特点。同时红酵母具有 适口性好,营养全面,无毒不占用育苗场地设施,不污染水质, 能有效提高苗种质量的 特点。目前国内的饲料还主要停留在较低水平状态,主要以传统的蛋白饲料为主。近 来国内有个别厂家开始工业化试生产红酵母饲料,国外已用于饲料添加剂中58。同 时红酵母还是天然色素源,因此研究红酵母的发酵条件可为进一步开发其系列产品打 下基础,并提供必要的实验依据。 （1）优良的饲料和食品添加剂 红酵母菌体中富含蛋白质、肝糖、高级不饱和脂肪酸、虾青素和天然生长激素等 物质, 因此能有效地促进个体生长, 以及能提高动物的受精率、减少胚胎的死亡率和 增强繁殖能力。而且红酵母菌体中含有的虾青素在抗氧化、消除自由基方面的功能均 优于- 胡萝卜素,可以促进抗体的产生和增强动物的免疫功能。虾青素主要积累在 虾、蟹、鱼体内, 呈红色。它使水产品更富有营养、色泽更为鲜艳、味道更加鲜美, 食用这些水产品对消费者的健康更有利。添加了红酵母菌的饲料中含有酵母及酵母生 长中产生的多种消化酶类和生长因子,可以有效地促进各种水产动物的消化吸收,提高 其对饲料的消化利用率。 （2）环境保护方面的应用 红酵母是一种腐生菌,可以分解多种物质,是天然的“清洁工”。海洋作为人类赖 以生存的生态环境,对地球整个生态的调节有着不可替代的作用。近年来,人们对海洋 环境的保护意识也在不断增强,石油污染问题引起了人们越来越多的关注。随着海上 石油开采及运输业的发展,石油泄漏事故逐年增多,受污染的海域范围不断扩大。据估 酵母毕业论文 7 计, 每年都有1000万t以上的石油污染世界海洋,对生物和生态环境造成了很大危害。 治理石油污染的关键是降解烃类化合物,利用天然微生物降解成为一种趋势。红酵母 就是一种最普遍的海洋石油烃降解菌。红酵母降解石油烃是个很复杂的过程,首先它 通过自身的代谢产生分解酶,裂解重质的烃类和原油,降石油的黏度;其次在其生长繁 殖过程中,还能产生诸如溶剂、酸类、气体、表面活性剂和生物聚合物等有效化合物 以利于驱油, 然后由其他的微生物进一步的氧化分解,成为小分子,从而达到降解的目 的。多氯联苯( PCB) 是一种高毒性化合物,有致癌作用,长期接触能引起肝脏损害和 痤疮样皮炎。使用PCB 而同时接触四氯化碳,则会增加肝损害作用,出现的中毒症状有 恶心、呕吐、体重减轻、腹痛、水肿和黄疸等多氯联苯由于化学性质稳定、热稳定、 惰性和介电特性, 曾广泛用作润滑材料、增塑剂、杀菌剂、热载体及变压器油等。 （3）微量元素富集中的应用 微量元素是动物维持生命和发育的必需营养物质。微量元素缺乏时会造成人及动 物营养不良并诱发多种疾病。矿物元素一般有无机态和有机态两种补充形式。大量的 实验表明, 有机态微量元素有容易被动物吸收和利用率高等特点。由于酵母菌兼具安 全性与丰富的营养,因此成为人们研究微生物富集微量元素的主要载体之一。某些种 类的红酵母除具有一般酵母的特点和含有以虾青素为主的类胡萝卜素外,还可以作为 富锌载体,不仅可以提高其营养价值,同时也是一种开发有机态锌源的有效方法, 具有 很好的商业价值。 （4）传统食品中的应用 红酵母米是一种传统并且延用至今的营养食品,它是由稻米发酵而得的。早在2 000 年前,中国人就已经知道利用红酵母来保健康。明代李时珍在本草纲目中评 价说: “此乃人窥造化之巧者也”,“奇药也”。据许多古代中药典集中记载,红酵母 米具有活血化瘀和健脾消食等功效,可用于治疗食积饱胀、产后恶露不净、痕滞腹痛 和跌打损伤等症。 1.2.3 酵母多糖的作用作用 （1）吸附病原菌作用 酵母细胞壁多糖能吸附病原菌的主要机理是: 甘露聚糖能干扰肠道病原菌的定殖, 从而降低动物肠道病原微生物数量如沙门氏菌和大肠杆菌的数量。肠道中的病原菌 (大肠杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等) 细胞表面或绒毛上具有一种蛋白质物质(类 丁质结构) , 通过识别动物肠壁细胞上的特异性, 而与之糖类结合, 在肠壁上定殖生长, 引起肠道疾病的发生。酵母细胞壁所含的甘露聚糖与病原菌在肠壁上的受体非常相似, 并与类丁质有很强的结合能力。因此, 甘露聚糖可竞争性地与病原菌结合。酵母细胞 壁物质具有耐酸解的特征, 可以完好地通过消化道而不受胃酸、消化酶等的破坏降解, 所以能携带病原菌通过肠道排出到体外, 由此而有效地减少了肠道疾病的发生。酵母 细胞壁对霉菌毒素也有很强吸附作用,能有效抵抗其毒性。研究还发现, 若对甘露聚糖 酵母毕业论文 8 进行一定的修饰, 其结合黄曲霉毒素、玉米赤霉菌毒素等霉菌毒素的能力将会进一步 提高。因此, 酵母细胞壁中的甘露聚糖被人们称作新型吸附剂, 具有广泛的应用价值。 （2）抗肿瘤作用 酵母细胞壁中的多糖物质有抗肿瘤的作用是因为它能刺激体内网状内皮系统产生 大量的巨噬细胞。啤酒酵母多糖呈现的抗肿瘤作用与酵母多糖活化机体巨噬细胞有直 接关系。因为, 酵母多糖在同瘤细胞混合接种给小鼠时, 表现出强烈的抗肿瘤效果, 可 是当加入巨噬细胞封阻剂硅粉后抑瘤作用显著下降, 乃至于消失。这一情况说明, 啤酒酵母多糖是巨噬细胞的激活剂, 它的抗肿瘤活性是通过机体巨噬细胞来实现的。 巨噬细胞杀伤瘤细胞需经激活过程, 受激活巨噬细胞通过吞噬作用或细胞毒作用攻击 瘤细胞。瘤细胞被吞噬后, 被巨噬细胞释放的溶酶体酶破坏或者是巨噬细胞释放毒性 因子杀伤与之接种的瘤细胞。 （3）减轻辐射损伤 酵母聚糖能减轻受照动物的辐射损伤。对酵母甘露聚糖对 812Gy60 Co - 射线辐 照小鼠的辐射防护作用进行研究, 发现鼠的存活率、成活天数、40 天体重的动态变化, 外同血 WBC、RBC 及 PLT 及脾指数等的数值差异上, 均显示出酵母甘露聚糖对 60Co- 射线辐射损伤有保护作用。通过这些研究, 甘露聚糖溶液研制成为辐射损伤 保护辅助药物有了实验依据。甘露聚糖制剂的生产也有了重要参数。 （4）抗病毒作用 研究发现酵母多糖具有明显的抗脊髓灰质炎病毒型、埃可病毒 6 型、柯萨奇病 毒 A16, B3, 新型肠道病毒 71 型、水泡性口炎病毒、腺病毒型、单纯疱疹病毒, 型的活性。其作用机制是: 酵母多糖不仅有能接灭活作用, 而且对细胞内外的病毒 都有抑制作用。 （5）激发、增进免疫功能 许多学者已经证实, 酵母多糖无毒无诱变性, 能明显增强免疫作用。酵母细胞壁含 有大量的 1 3 D 葡聚糖和甘露聚糖, 对细菌、真菌和病毒引起的疾病以及运 输、转群、接种、气候等引起的应激反应产生非特异性免疫力 。研究发现甘露聚糖 具有激活免疫系统应答的作用。酵母多糖能显著增强增红细胞免疫黏附能力。硫酸酯 化处理后的酵母甘露聚糖的抗炎功能显著提高。研究表明酵母多糖被脂质体包封后, 其免疫增强作用表现突出, 免疫功能强烈被激活。 1.2.4 酵母多糖在食品中应用用 食品工业中常见的酵母菌在一定条件下可发酵产生具有生物活性的胞壁多糖, 这 些多糖物质在食品中具有相当的应用价值。 （1）酵母多糖增稠剂 用热水溶解得到的溶液, 其黏度冷却后要比用冷水高,胶浓度 5%以上, 黏度随浓度 酵母毕业论文 9 增加而大幅度上升, 但黏度值受温度及酸度的影响。酵母多糖与洋槐豆胶有协同作用, 与 CMC 混用也能增加黏度, 此外酵母多糖有较好的冷冻/融化稳定性, 8%的酵母多糖 溶液经加热至 95冷却后能形成凝胶。 （2）乳化剂 由于共价结合到蛋白质骨架上的甘露糖的存在使酵母细胞壁的甘露糖蛋白具有与 表面活性剂和许多乳化剂相同的亲水亲油性结构。另外, 葡聚糖也有较好的油水乳化 稳定性。所以酵母细胞壁可以充当乳化剂的角色。据报道在油- 水系统中加入酵母胞 壁多糖, 经搅拌后, 能形成非常细腻如同奶酪质地的、稳定性好的乳状物。 （3）低热、防龋齿食品原料 葡聚糖属于低热量的食品原料, 不易被人体消化吸收, 因此可代替高热量糖类物质 加入到食品中, 能有效降低血糖量的增加, 预防糖尿病,及控制肥胖症。葡聚糖在口腔 内, 不能被产生龋齿的细菌分解、产酸, 而腐蚀牙齿, 因此还可达到防治龋齿的作用。 1.3 高密度培养 高密度培养没有确切的定义,是一个相对概念,指应用一定的培养技术和装置提高 菌体的发酵密度,使菌体密度较普通培养有显著的提高,最终提高特定产物的比生产率。 用以描述的单位是干细胞重量/升(DCW/L) 12。广义来讲,凡是细胞密度比较高,以至 接近其理论值的培养均可称为高密度培养,一般认为其上限值为150200g(DCW/L),下 限值为2030g(DCW/L) 2。与常规培养相比,高密度培养在发酵过程中有明显优势。 它可以提高菌体的发酵密度或单位体积培养液中菌体的浓度,进而提高体积产率；可 以缩小生物反应器体积,减少生产设备投资；强化下游分离提取,并在一定程度上减少 废水量；综合提高比生产率,加速产品的商品化进程,降低生产成本,并提高产品在市 场上的竞争力。 优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养 基和合成培养基三种。合成培养基成分和浓度已知且可以控制常用来获得高细胞密度； 复合培养基含有提取物(如蛋白胨，酵母提取物)，营养物的成分和质量可能不同，故 复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而，复合培养基和半合成培基对促进产物 生成是必要的，而且在复合培养基和半合成培基中，细胞生长往往比在合成培基中快。 为使细胞生长达到高密度，有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基，以维持 细胞生长，同时避免生长的抑制。 1.4实验内容及意义 1.4.1 实验内容 高细胞密度发酵试验方案需遵循以下原则： （1）使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率。 （2）细胞的生长速率应优化，使得碳源能被充分利用和获得较高的产率，用养分流 酵母毕业论文 10 加来限制菌体的生长速率还能控制培养物对养的需求和产热速率。 （3）用碳源作为限制性养分是为了能得到最大的细胞浓度和减轻恒化培养所需要。 A.培养条件优化实验步骤如下： （1）温度对红酵母细胞密度的影响。 （2）PH 值对红酵母细胞密度的影响。 （3）溶解氧浓度对红酵母细胞密度的影响。 （4）碳源对红酵母细胞密度的影响。 （5）氮源对红酵母细胞密度的影响。 （6）碳氮比对红酵母细胞密度的影响。 （7）培养方法（分批补料）对红酵母细胞密度的影响 B酵母多糖提取实验步骤： （1）提取工艺路线：酵母溶解冻融一超声波破碎一碱溶一中和一沉淀一洗涤 烘干。 （2）多糖得率 的计算 （3）测定多糖含量（p）硫酸-苯酚法 （4）超声波破碎工序的工艺参数选择 （5）碱溶工序的工艺参数选择 1.4.2 红酵母高浓度培养及提取酵母多糖的意义 红酵母对于我国研究开发满足珍稀水产品养殖需要的高质量饲料和饵料具有十分 重要的意义。由于红酵母具有富含蛋白质和虾青素、营养条件低、能利用的廉价原料、 菌体无毒、培养周期短和生产易控制等工业化生产特点。因此,红酵母是潜在的可工 业化生产的优质水产品饲料源。若以整体或破碎细胞添加入饲料中, 不但能提供必需 的蛋白质和其它蛋白饲料,不能提供的营养物、营养素, 而且还能克服传统水产养殖 饲料利用率低、水污染严重等缺点,并能避免因饲料中化学合成添加剂如色素、抗生 素等在动物肌肉、蛋、奶中蓄积残留给动物生态环境和人类健康带来危害。同时,随 着富硒、铬、锌、钙等面包酵母生产的成功,更为开发红酵母产品提供了一定技术和 思路, 若能研究出红酵母的类似产品, 将更进一步增加其用途、强化其功能、提高其 使用价值,并带来更大的经济效益和社会效益。因此,可以说红酵是值得开发的“绿色” 蛋白饲料或饲料添加剂。 随着科学技术的发展, 多糖的活性功能已经被人们所认识。而酵母细胞壁多糖作 为多糖中的一种, 其研究也在不断深入。酵母细胞壁中 60%是多糖,其主要成分是葡聚 糖和甘露聚糖，它们在人的消化道中难以被消化,可以作为膳食纤维发挥作用，并具有 增强免疫力、提高巨噬细胞活性、抗病毒等功效；酵母多糖在食品中还可做增稠剂； 还有保湿、成膜、无刺激性的特点。故广泛用于医药、食品、化妆品、饲料等行业， 也被称为“生物反应修饰物（BRM） ” 。存在于灵芝、香菇、酵母等真菌类生物中的多 酵母毕业论文 11 糖是一种功能因子，有抗辐射，抗病毒（增强免疫力） ，清肠排毒（清除体内毒素和 垃圾）等功能。在食品工业中, 酵母细胞壁多糖能充当乳化剂、增稠剂、低热食品原 料等角色。为了更好的利用酵母细胞壁多糖的功能价值, 更充分的为人类健康服务,我 们需要探索更好的提取酵母多糖的工艺。 材料与方法 2.1材料 2.1.1菌种 红酵母( Rhodotorula glutinis) ,CICC编号31229。 2.1.2培养基 （1） 斜面活化培养基 葡萄糖2%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠1%,硫酸镁0.3 %,磷酸二氢钾0.7%,蒸馏 水100mL,pH4.85.0。 （2）发酵培养基 葡萄糖2.5%,蛋白胨1%,酵母膏0.5 %,氯化钠1%,硫酸镁0.03%,磷酸二氢0.7%,蒸馏 水100mL,pH4.85.0。 （3）种子培养基 葡萄糖2.5%,蛋白胨1%,酵母膏0.5 %,氯化钠1%,硫酸镁0.01%,磷酸二氢钾0.15%, 蒸馏水100mL,pH4.85.0。 2.1.3多糖提取材料 酵母、氢氧化钾、35%醋酸、95%乙醇、浓硫酸 丙酮、乙醚、苯酚(均为分析纯) 2.1.4主要仪器 仪器名称型号生产厂家 1000L5000L取样器 回转式恒温调速摇瓶柜 HZQ-Q 东联电子技术开发有限公司 8037-SGS超型自动压力蒸气灭菌器上海精宏设备有限公司 T-500型电子天平 电热恒温箱SHP-250型上海精宏设备有限公司 PHS-3C酸度计 生物显微镜 血球计数板 超声波细胞粉碎机TY92一II型 电热恒温水浴锅HHsyl1-Ni2型北京长源实验设备厂 酵母毕业论文 12 精密增力电动搅拌器JJ一1型常州国华电器有限公司 低速自动平衡离心机KDZ52型北京医用离心机厂 可见光分光光度仪722S型 真空干燥箱 DZF-6020 2.2分析方法 2.2.1用血球计数板计数法测红酵母细胞密度9。 血球计数板计数的操作步骤如下： 取清洁的血球计数板，将洁净的专用盖片置两条嵴上。 将液体培养基上的菌液进行稀释，以便于对菌液进行计数。 摇匀稀释的菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，从盖片的边缘滴一小滴（不宜过 多），使菌液自行渗入平台的计数室。加菌液时注意不得使计数室内有气泡，两个平 台上都滴加菌液后，静置约5 min。在低倍镜下找到方格网后，转换高倍镜进行观察 和计数。 不同规格的计数板的计数方法略有差异。1625 规格的计数板，需要按对角线 方位，计算左上、左下、右上和右下 4 个大格（共 100 小格）的菌数。若是 2516 规格的计数板，除统计上述 4 个大格外，还须统计中央一大格（共 80 小格）的菌数。 位于两个大格间线上的菌体，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数。每个样品重复 计数 2-3 次（每次数值不应相差过大，否则重新操作） ，取其平均值。 按以下公式计算出每毫升菌液中所含的细胞数： a. 1625 规格的计数板： 细胞数/mL=4001000菌液稀释倍数 100 100个小格内细胞数 b. 2516 规格的计数板： 细胞数/mL=4001000菌液稀释倍数 80 80个小格内细胞数 2.2.2 多糖的计算多糖的计算 多糖得率=(粗多糖质量/啤酒酵母质量)100% 多糖含量 p=（测得的多糖总量/粗多糖）100%。 以糖微克数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，可制得标准曲线。测吸光度，以标 准曲线计算多糖的含量 2.3实验内容与方法 酵母毕业论文 13 2.3.1细胞扩大培养 （1） 斜面活化 将保藏的菌种接种到斜面培养基上活化。28培养 48h。 （2） 种子培养 以10%接种量接入与种子培养基相同的培养基中,装量100mL/500mL,28,200 r/min,培养12h。 （3） 菌种培养 以10%接种量接入与种子培养基相同的培养基中,装量100mL/500mL,28,200 r/min,培养12h。 2.3.2碳源对红酵母细胞密度的影响 选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖3种不同的糖类作为碳源，确定适宜酵母生长的糖类， 在其余成分相同的情况下作了比较试验。数据(3次重复实验平均值)。 葡萄糖2.5，蛋白胨1.0，酵母膏0.5，磷酸二氢钾0.15，硫酸镁 0.01，氯化钠10，初始pH5.0，接种量10，500mL三角瓶中培养基装量为 100mL，发酵温度为28，摇床200rmin。 碳源葡萄糖蔗糖麦芽糖 浓度 2.5%2.5%2.5% 2.3.3 碳源浓度对红酵母细胞密度的影响 从上面的实验确定最适宜糖类为葡萄糖，以下实验确定最适宜酵母生长的葡萄糖 的浓度。浓度梯度分别为1、2、3、4、5、6、7、8%，在其余成分相同的情况下作了 比较试验。数据(3次重复实验平均值)。 初始葡萄糖1，蛋白胨1.0，酵母膏0.5，磷酸二氢钾0.15，硫酸镁 0.01，氯化钠1.0，初始pH5.0，接种量8，500mL三角瓶中培养基装量为 100mL，发酵温度为28，摇床200rmin。 葡萄糖梯度 1%2%3%4%5%6%7%8% 2.3.4 氮源对红酵母细胞密度的影响 硫酸铵、蛋白质为酵母生长的氮源，确定最适宜酵母生长的氮源种类及其浓度。 （1）硫酸铵浓度的影响 确定最适宜酵母生长的硫酸铵的浓度。浓度梯度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8%。在其余成分相同的情况下作了比较试 验。数据(3次重复实验平均值)。 酵母毕业论文 14 葡萄糖2，硫酸铵0.1，酵母膏0.5，磷酸二氢钾0.15，硫酸铵0.01， 氯化钠1.0，初始pH5.0，接种量8，500mL三角瓶中培养基装量为100mL，发酵温 度为28，摇床200rmin。 硫酸铵 浓度梯 度 0.1%0.2%0.3%0.4%0.5%0.6%0.7%0.8% （2）蛋白胨浓度的影响 确定最适宜酵母生长的蛋白胨的浓度。浓度梯度分别为 0.25、0.5、1、1.5、2、2.5，在其余成分相同的情况下作了比较试验。数据(3次重 复实验平均值)。 葡萄糖 2，蛋白胨 0.25，磷酸二氢钾 0.15，硫酸铵 0.01，氯化钠 1.0，初始 pH5.0，接种量 8，500mL 三角瓶中培养基装量为 100mL，发酵温度为 28，摇床 200rmin。 蛋白胨浓度 梯度 0.25%0.5%1.0%1.5%2.0%2.5% 2.3.5pH 对红酵母细胞密度的影响 在测试pH的影响时,为避免培养基灭菌及酵母生长过程中pH的变化,在选择缓冲液 时,考虑到缓冲容量及缓冲液成分是否会被用作营养物质,选用了邻苯二甲酸氢钾-KOH 和磷酸缓冲液来配培养基使之达到不同的恒pH。配备4.5、5、5.5、6不同pH的培养液， 在其余成分相同的情况下作了比较试验。数据(3次重复实验平均值)。 葡萄糖 2，蛋白胨 1.0，磷酸二氢钾 0.15，硫酸铵 0.01，氯化钠 10，初始 pH4.5，接种量 8，500mL 三角瓶中培养基装量为 100mL，发酵温度为 28，摇床 200rmin。 PH 梯度 4.55.05.56.0 2.3.6 接种量对红酵母细胞密度的影响 接种量对红酵母菌数影响较大8。选择上述优化的培养基(2%的葡萄糖为源,1.5% 的蛋白胨为氮源,在其余成分相同的情况下作了比较试验),选择接种量在6%14%之间 分成6.8.10.12.14%5组进行试验, 数据(3次重复实验平均值)。 葡萄糖 2，蛋白胨 1.5，磷酸二氢钾 0.15，硫酸铵 0.01，氯化钠 1.0， 初始 pH5.0，接种量 4，500mL 三角瓶中培养基装量为 100mL，发酵温度为 24，摇 床 200rmin。 酵母毕业论文 15 接种量 4%6%8%10%12%14% 2.3.7摇瓶装量对红酵母细胞密度的影响 不同的摇瓶装量对红酵母菌数影响较大11。在上述优化的培养基条件下(2%的葡 萄糖为碳源,1.5%的蛋白胨为氮源,在其余成分相同的情况下作了比较试验),选择装量 从40 mL/500mL三角瓶到140mL/500mL三角瓶分为40，60，80，100，120，140ml6组进 行试验,数据(3次重复实验平均值)。 （1）葡萄糖2，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾0.15，硫酸铵0.01，氯化钠 1.0，初始pH5.0，接种量8，500mL三角瓶中培养基装量为40mL，发酵温度为26， 摇床200rmin。 装量 40ml60ml80ml100ml120ml140ml 2.3.8 温度对红酵母细胞密度的影响 温度对红酵母菌数影响较大，选择上述优化的培养基(2%的葡萄糖为碳源,1.5 % 的蛋白胨为氮源在其余成分相同的情况下作了比较试验) ,选择培养温度在2432 之间分成24，26，28，30，325组平行试验, 数据(3次重复实验平均值)。 葡萄糖2，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾0.15，硫酸铵0.01,氯化钠1.0，初 始pH5.0，接种量8，500mL三角瓶中培养基装量为100mL，发酵温度为28，摇床 200rmin。 温度梯度 2426283032 2.3.9不同因素对红酵母细胞密度的影响 培养基优化采用三因素三水平L9(33) 正交试验,共设有9组处理,每个处理有3 组重复试验,各参数的水平值,根据单因素试验的结果,选择葡萄糖、蛋白胨、酵母膏 作正交试验,具体水平设置见下表。 水平葡萄糖（A）蛋白胨（B）酵母膏（C） 11.51.00.5 22.01.51.0 32.52.01.5 2.3.10最终培养基的确定 通过正交验的优化组合,得到红酵母菌数的最优培养基及培养条件条件。用优化 的培养基在最适培养条件下培养红酵母，从而测定红酵母的最终密度。 2.42.4酵母多糖提取酵母多糖提取 2.4.12.4.1提取工序提取工序 酵母毕业论文 16 酵母溶解：称取干酵母粉，用一定体积的纯水溶解。 冻融：将酵母沉淀置于-20下冷冻 2h，再置于 100水中骤然升温使其融化， 如此反复 3 次。 超声波破碎：确定超声波破碎时间和功率，选择最佳破碎时间和功率。 碱溶：确定碱浓度、温度、时间等条件，选择最佳工艺。 中和：室温放冷，用醋酸中和至 pH 值为 67，离心静置，收集上清夜。 沉淀：以 95%乙醇作沉淀剂，沉淀 12h，乙醇与上清液的体积比为 2：1。 洗涤 ： 沉淀用丙酮洗涤 2 次，用乙醚洗涤 1 次。 烘干： 30下干燥 12h。 2.4.22.4.2多糖得率多糖得率的计算的计算 多糖得率 =(粗多糖质量/啤酒酵母质量)100%。 2.4.32.4.3测定多糖含量（测定多糖含量（p）硫酸硫酸-苯酚法苯酚法 多糖含量p=（测得的多糖总量/粗多糖）100%。 （1） 标准曲线的制作 分别吸取标准葡萄糖溶液(40g/ml)0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8ml 置 于比色管中，分别补水至 2.0ml，再加入 6%苯酚 1.0ml 后，置冷水中迅速加入浓硫酸 5.0ml，摇匀后于冷水中放置 5min,然后置沸水浴中加热 15min，再置冷水中放置 5min，最后于 490nm 波长下测吸光度。以 2.0ml 水按同样显色操作为空白样，横坐标 为多糖微克数，纵坐标为吸光度值，可制得标准曲线。 （2）酵母多糖含量的测定 称取酵母粗多糖 5mg 置于 100ml 容量瓶中定容、摇匀。吸取样液 1.0ml（相当于 40g 左右的多糖） ，按上述步骤操作测吸光度，以标准曲线计算多糖的含量。 2.4.42.4.4超声波破碎工序的工艺参数选择超声波破碎工序的工艺参数选择 选择功率、工作次数、浓度为因素进行正交试验，工序因素-水平见表 1。 2.4.52.4.5碱溶工序的工艺参数选择碱溶工序的工艺参数选择 选择浓度、温度、时间为因素进行正交试验， 碱溶工序因素-水平见表 2。 第三章第三章 实验结果及分析实验结果及分析 酵母毕业论文 17 3.1培养条件优化结果及分析 3.1.1基础发酵培养基中的菌数 在基础培养基中,红酵母的产菌量为5.6亿个/mL。 3.1.2碳源对红酵母细胞密度的影响 选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖3 种糖作碳源10, 在其余成分相同的情况下作了比较 试验。数据( 3 次重复实验平均值) 123 平均 葡萄糖（亿ml） 7.06.96.86.9 蔗糖（亿ml） 5.15.45.55.3 麦芽糖（亿ml） 4.95.05.45.1 结果表明红酵母对葡萄糖利用最好,在葡萄糖为碳源的培养基中菌数最高,为 6.9 亿 个/mL, 因此葡萄糖为最佳的碳源。 3.1.3碳源浓度对红酵母细胞密度的影响 选择1%8%葡萄糖浓度进行试验,数据(3次重复实验平均值)在其余成分相同的情 况下作了比较试验 1% 234567 8% 16.87.37.07.26.66.56.76.6 26.87.47.17.06.76.46.86.7 36.87.27.27.16.86.66.66.5 平均（亿 ml） 6.87.37.17.16.76.56.76.6 酵母毕业论文 18 结果表明随着葡萄糖浓度增加菌数也增大, 当葡萄糖浓度增加到2%时菌数最高, 达7.3亿个/mL。但随后,葡萄糖浓度再增加反而降低,当葡萄糖浓度达到8%时,菌数只 有6.6亿个/mL,比葡萄糖浓度2%时的菌数(7.3亿个/mL)下降了9.6%。由此表明,较低的 葡萄糖浓度(2%)时菌数才能达到较高的水平。考虑到对菌数的要求,选择2%葡萄糖浓 度为碳源作为进一步试验的糖浓度。当葡萄糖2%时,菌数达7.3亿个/mL,比发酵培养基 ( 5.6 亿个/mL) 提高了23.3%,达到了初步优化培养条件的目的。 3.1.4 pH对红酵母细胞密度的影响 在测试pH的影响时,为避免培养基灭菌及酵母生长过程中pH的变化,在选择缓冲液 时,考虑到缓冲容量及缓冲液成分是否会被用作营养物质,选用了邻苯二甲酸氢钾- KOH 和磷酸缓冲液来配培养基使之达到不同的恒pH。选择上述优化的培养基(2%的葡 萄糖为碳源,1.5%的蛋白胨为氮源,其余成分同原培养基) ,作pH在4.56.0之间的试 验,以确定最适的pH值。数据(3次重复实验平均值) 。 pH值 4.555.56 17.47.876.1 27.77.46.95.8 37.37.67.15.8 平均(亿ml) 7.57.675.9 酵母毕业论文 19 结果表明在pH4.56.0 之间,pH 对菌数有一定的影响。在pH5.0 时,菌数最高为7.6 亿个/mL,在pH6.0时菌数最低为5.9 亿个/mL,变化幅度为28.8%。因此,进一步试验选 择pH 值为5.0。 3.1.5氮源对红酵母细胞密度的影响 （1）硫酸铵浓度的影响 2%葡萄糖为碳源,硫酸铵(浓度为0.1%0.6%)为氮源,其余培养基成分同发酵培养 基, 数据(3次重复实验平均值) 0.10.20.30.40.50.6 14.74.94.24.34.44.3 24.6