《酶的分离纯化》PPT课件.pptVIP

Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 制作：郑穗平 Contents of chapter 3 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 Go Go Go Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶 Go 细胞结构与酶分布 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。 酶的纯纯化过过程，约约可分为为 三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质 打破细细胞 抽出全蛋白 ，多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质质以外的 物质质。 (2) 部分纯纯化 (partially purified): 初步的纯纯化，使用各钟钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的 进一步精制纯纯化，可用制 备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 本章 目录 3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 JY92-II D超声波 细细胞粉碎机 细细胞破碎珠 高压细压细 胞破碎机 DY89-I型 电动电动 玻璃匀浆浆机 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎 细细胞破碎方法及其原理 本章 目录 l酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料， 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 l酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说 来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶 剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 l酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取， 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 酶的提取 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。 酶的主要提取方法 提取方法使用的溶剂或溶液提取对象 盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶 液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 有机溶剂提 取 可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶 大多数蛋白类酶都溶于水，而 且在低浓度的盐存在的条件下 ，酶的溶解度随盐浓度的升高 而增加，这称为盐溶现象。 本章 目录 3.4 酶的分离方法 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 Go Go Go Go 5、电泳分离 Go 6、萃取分离 Go 本章 目录 1、沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度 降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 沉淀分离方法分离原理 盐盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓 度条件下溶解度不同的特性， 通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质 从溶液中 析出沉淀，从而使酶与杂质 分离 等电电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电 解质有不同的等电点这一特性，通过调节 溶液的pH值，使 酶或杂质 沉淀析出，从而使酶与杂质 分离 有机溶剂剂沉淀法利用酶与其它杂质 在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一 定量的某种有机溶剂，使酶或杂质 沉淀析出，从而使酶与杂 质分离 复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来， 从而使酶与杂质 分离 选择 性变性沉 淀法 选择 一定的条件使酶液中存在的某些杂质变 性沉淀，而不影 响所需的酶，从而使酶与杂质 分离 在盐浓度达到某一界限 后，酶的溶解度随盐浓 度升高而降低，这称为 盐析现象。 在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋 白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数） ，通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、 氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而 且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行 盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其 它中性盐进行盐析。 在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间 的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也 使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 本节 目录 2、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小 、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力 （RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞 碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 1104 1105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。 为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机 装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子 以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子 质量的测定等。 超速离心机按照其用途可以分为制备 用超速离心机、分析用超速离心机和 分析-制备两用超速离心机3种 蛋白质分子在离心時， 其 分子量、分子密度、 组成、形状 等，均会影 响其沉降速率，沉降係 系数 即用來描述此沉降 性质； 其单位为 S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其 分子密度或分子量成正 比。 不同沉降系数的蛋 白质，可利用超高速离 心法，在密度梯度中作 分離。 本节 目录 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金 属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。 过滤 非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤过滤 的分类类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤 介质 粗滤滤 2m酵母、霉菌、动物细胞 、植物细胞、固形物等 滤纸 、滤布、纤维 多孔陶瓷、烧结 金 属等 微滤滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷 超滤滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜 反渗透20 (40,000) 压力差， 100kPa 筛分 超滤 UF 120 (10,000-40,000) 压力差， 100kPa 筛分 纳滤 NF 1 (1001000) 压力差， 100) 压力差， 1000kPa 优先吸附、溶解 扩散 四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用膜分离过过程的截留特性 本节 目录 4、层析分离 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利 用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同 程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)， 另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速 度移动，从而达到分离。 层层析分离方法 层析方法分离依据 吸附层层析利用吸附剂对 不同物质的吸附力不同而使混合物中 各组分分离 分配层层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分 分离 离子交换层换层 析利用离子交换剂 上的可解离基团（活性基团）对各 种离子的亲亲和力不同而达到分离目的 凝胶层层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种 组分的相对对分子质质量不同而达到物质分离 亲亲和层层析利用生物分子与配基之间所具有的专专一而又可逆的 亲亲和力，使生物分子分离纯化 层层析聚焦将酶等两性物质的等电电点特性与离子交换层 析的特 性结合在一起，实现组 分分离 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的 吸附力不同而使混合物中各组分分离 的方法。吸附层析是各种层析技术中 应用最早的技术。吸附剂来源丰富、 价格低廉、可再生，吸附设备简单。 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂 装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。 层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入 ，当样品液全部进入吸附层析柱后，再 加入洗脱剂解吸洗脱。 在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸 附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法 置换洗脱法 前缘洗脱法 分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分 分离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡 时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后， 层析系数是一常数。 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅 藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过 程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶 的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的 带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析 离子交换层析是利用离子交换剂 上的可解离基团（活性基团）对 各种离子的亲和力不同而达到分 离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团 的不溶性高分子物质。通过在不 溶性高分子物质（母体）上引入 若干可解离基团（活性基团）而 制成。 按活性基团的性质不同，离子交 换剂可以分为阳离子交换剂和阴 离子交换剂。由于酶分子具有两 性性质，所以可用阳离子交换剂 ，也可用阴离子交换剂进行酶的 分离纯化。 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层 析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝 胶为固定相，利用流动相中所含各种组 分的相对分子质量不同而达到物质分离 的一种层析技术。 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各 种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时， 大分子物质由于分子直径大，不能进入 凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间 隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小 的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进 出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小 分子物质向下移动的速度比大分子的速 度慢，从而使混合溶液中各组分按照相 对分子质量由大到小的顺序先后流出层 析柱，而达到分离的目的。 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用生物分子与配基之间 所具有的专一而又可逆的亲和力，而 使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅 助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的 RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子 或片段等之间，都是具有专一而又可 逆亲和力的生物分子对。故此,亲和 层析在酶的分离纯化中有重要应用. 亲和层析的四个要素 常用的亲和介质及专一性配体 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 疏水层析与反相层析的基本原理 本节 目录 5、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移 动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为： 纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳 颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身 所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大 小的影响。此外，还受到电场强度、溶液 pH值、离子强度及支持体的特性等外界条 件的影响。 制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收 具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不 佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。 本节 目录 6、萃取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技 术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也 可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为： 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 各种双水相系统统 聚合物P 聚合物Q或盐 聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯 醇，聚乙烯吡咯烷酮 ，羟丙基葡聚 糖，葡聚糖 聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纤维 素羟甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羟乙基纤维 素葡聚糖 羟丙基葡聚糖葡聚糖 聚蔗糖葡聚糖 聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠 ，酒石酸钾钠 某些超临临界流体的超临临界点和超临临界密度 流体名称临界温度()临界压力 (Mpa) 临界密度 （g/ml） 乙烷C2H632.34.880.203 丙烷C3H896.94.260.220 丁烷C4H10152.03.800.228 戊烷C5H12296.73.280.232 乙烯C2H49.95.120.227 氨NH3132.411.280.236 二氧化碳 CO231.17.380.46 二氧化硫 SO2157.67.880.525 水H2O374.322.110.326 笑气N2O36.57.170.451 氟里昂C28.83.900.578 本节 目录 3.5 酶的组合分离纯化策略 Re