SDS-PAGE-00.doc

Tricine-SDS PAGE实验仪器： 垂直电泳槽，电泳仪，移液器，微量进样器实验材料： 3凝胶缓冲液，阴极缓冲液，阳极缓冲液，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺混合液（AB）,上样缓冲液，固定液，考马斯亮蓝染液，脱色液注：以上试剂配制见 附表： 1实验步骤： 1用去离子水冲洗胶版，电泳槽。 2安置好密封胶条，用在电泳槽上夹紧胶板。 3按下表配制SDS PAGE。（先配制分离胶）试剂配制量浓度浓缩胶4%分离胶10%分离胶16%2.5m5ml5ml10ml5ml10ml3凝胶缓冲液0.6ml1.2ml1.65ml3.3ml1.65ml3.3mlAB0.2ml0.4ml1ml2ml1.65ml3.3mlH2O1.68ml3.36ml1.82ml3.64ml1.18ml2.36ml甘油000.5ml1ml0.5ml1ml10%AP20l40l25l50l15l30lTEMED2l4l3l6l2l4l 4先配制分离胶，加入TEMED后，迅速混匀，倒入胶版中。约距离短板3.5cm处，用水封。 5约1h 后，胶版上可以看到清晰的水胶界面，倒净上层水，迅速将混合好的浓缩胶倒入胶版，然后插入梳子。静置2h。 6将电泳槽放置于冰盒中，在电泳槽内槽中加入阴极缓冲液。液面没过胶板的凹槽。 7在电泳槽外槽中加入阳极缓冲液。液面不低于阴极缓冲液的液面。 8用微量进样器将混合上样缓冲液的样品假如到样品槽中。 9接好电源。注意正负极不要接反。70V恒压电泳（电流不易过大），三个小时后观察。即，溴酚蓝条带大约离胶板1-2cm时。 10取出胶板，用去离子水缓缓的冲去胶板上的泡沫，用刀片轻轻撬开胶板，取出SDS-PAGE 胶，用去离子水缓缓冲洗3-5次。 11将SDS-PAGE 胶置于固定液中固定30min，然后轻轻取出胶，用去离子水冲洗3-5次。 12将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染液中，37 缓慢震荡（50rpm）染色2h。 13当条带显现出来后，用去离子水反复冲洗胶。然后将胶置于脱色液中，37，震荡脱色。当脱色液颜色太深的时候，换新的脱色液，直到条带清晰显现。 附表：1试剂所需药品用量浓度3凝胶缓冲液Tris18.16g3M Tris-HCl; 0.3% SDS;pH 8.455N HCl (86.2mlHCl+ 113.8ml H2O)10ml 20% SDS0.75mlH2O补足50ml阴极缓冲液Tris12.11g100mM Tris-HCl；100mM Tricine；0.1% SDS；pH 8.25Tricine17.92g20% SDS5mlH2O补足1L阳极缓冲液Tris12.11g100mM Tris-HCl；pH 8.95N HCl3mlH2O补足1LAB混合液Acr24g48% Acr；1.5% Bis；99.5T；3C；Bis0.75gH2O补足50ml3上样缓冲液0.5M Tris-HCl pH7.03ml150mM Tris-HCl6% 巯基乙醇12% SDS30% 甘油-巯基乙醇 0.6mlSDS1.2g甘油3mlH2O补足10ml溴酚蓝5mg凝胶固定液甲醇250ml50% 甲醇10% 冰醋酸冰醋酸50mlH2O补足500ml染色液考