《转基因小鼠技术》PPT课件.ppt

转基因小鼠技术 -转基因小鼠的构建 李懿萍 2010.05.20 Date1 基因打靶的简易程序 Date2 优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位 、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛 选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 胚胎干细胞（ES细胞）法 Date3 Date4 主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域 具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR 下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒, 去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基 因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。 3、逆转录病毒感染法 Date5 3、逆转录病毒感染法 优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高 度整合特性, 大大提高基因转移的效率 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中 扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 获得纯合体的转基因动物的机会少 病毒载体构建复杂 转入的外源基因的大小受到限制, 300kb。 F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞 。100kb,近百个蛋白质。 可构建BAC文库； 有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre 重组酶； BAC载体两端有Sp6和T7 引物序列利于测序，确定基因的 染色体定位； 可稳定遗传，易于操作。 BAC文库：基因组酶切后100300kbDNA+BAC大肠杆菌 Date13 方 法 显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因 敲除 精子介导 优 点 外源基因整合 效率较高，不 需要载体，目 的基因的长度 可达100Kb 转基因效率 高；预测基 因表达水平 ；可以使用 定点整合技 术 外源DNA的 整合率高； 整合在生殖 细胞中的比 例也很高。 可在整合点 整合转移基 因的单个拷 贝； 该方法简 单、方便 缺 点 精密仪器， 技术操作较 难，易造成宿 主动物基因组 的插入突变 供体细胞易 衰老 ES细胞株不 易建立，长 期培养后出 现分化现象 ；生产的转 基因动物都 是嵌合体 插入的基因 有大小限度 ；嵌合性很 高；外源DNA 在动物各种 组织中的分 布不均 应用 具有 一定 局限 性 有些结果 不能重复 基因转移方法的比较 Date14 Electroporation Date15 Date16 Date17 Date18 Date19 1 2 3 4 5 6 Date20 1 25 6 4 3 Date21 Date22 Date23 Date24 转基因小鼠技术 -转基因小鼠在科研中的应用 Date25 1. 7500万1.25亿年前 - 人鼠始祖 小鼠的历史 2. 19世纪 - 宠物鼠-实验鼠的“先驱” 3. 1897年 - 重组表型 Date26 4. 1900年 - 从宠物鼠到实验鼠 Abbie Lathrop-饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传 学研究。哈佛大学-老鼠的毛色进行观察，以检测 孟德尔法则的正确性。 小鼠的历史 5. 1905年 - 孟德尔老鼠 通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家 Lucien Claude Cuno 发现，两个携带黄色皮毛基因 的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老 鼠的数量比总是2:1。-这是报道的第一个等位纯合 致死的基因。 Date27 Clarence Cook Little是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育 出了第一个近亲繁殖的小鼠株系DBA。 小鼠的历史 6. 1909年 - 实验鼠的诞生 Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不 会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。 7. 1916年 - 肿瘤易受性和组织相容性 Jackson实验室的George Snell在1940年代发现了组织相容性基因-荣 获了1980年的诺贝尔奖 Date28 8. 1921年 - C57BL株系 基因组测序在2002年完成 小鼠的历史 9. 1929年 - Jackson 实验室 -世界上最重要的小鼠遗传学研究中心 在Hudson 汽车公司的头目Edsel Ford 和Roscoe Jackson两位大财主的资助下 ，Charence Little 在美国缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室 Date29 10. 1953年 - DNA双螺旋 Crick，Watson和Wilkins三人因为这项 杰出的成就荣获了1962年的诺贝尔奖。 11. 1966年 - 遗传密码破译 Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破 译了遗传密码-1968年的诺贝尔奖 小鼠的历史 Date30 12. 1972年 - 小鼠遗传学的计算机数据库 Jackson 实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库 13. 1977年 - Sanger 测序法 和同事Walter Gilbert分享了1980年的诺贝尔化学奖-人类和小鼠基因 组测序过程中的主要技术 14. 1982年 - 转基因小鼠 小鼠的历史 Date31 16. 1987-89年 - 第一只基因敲除小鼠 Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几 个研究小组- 2001获得了Lasker奖 17. 1996年 - “百慕大法则” 公共基因组序列数据 18. 1998年 - 克隆鼠 1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第 一批克隆鼠“Cumulina”和她的姐妹们。 15. 1983年 - PCR Kary Mullis -1993年的诺贝尔奖 小鼠的历史 Date32 19. 1999年 - 小鼠基因组测序协会 人类基因组三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因 组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC) 20. 2001年2月 - 人类基因组 21. 2001年6月 - 散弹法 美国公司Celera Genomics 使用散弹法测得了 用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一 次性测得基因组全序列的技术。 小鼠的历史 Date33 22. 2002年5月 - 16号染色体与已被分析的人类 21号染色体序列高度相似 23. 2002年8月 - 小鼠基因组物理图谱 24. 2002年12月 - 小鼠基因组 小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图， 并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为 2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有 40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小 鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组 成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN 基因组科学实验室 的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。 小鼠的历史 Date34 转基因小鼠技术的应用 基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究 基因工程定向育种 转基因动物生物反应器研制 人类疾病小鼠模型与基因治疗 药理学研究 器官移植 环境科学研究 Date35 基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究 Hox gene(同源异形盒基因） 疾病基因 学习与记忆基因 生理周期基因 基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控； Date36 基因工程定向育种 向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达， 能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种 之间遗传物质的交换。 实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其 精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异， 从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。 转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等 Date37 转基因动物生物反应器研制 转基因动物生物反应器概念： 将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入 动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外 源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些 组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基 因产物。 乳腺-理想器官 肾脏和膀胱 多肽药物、蛋白质疫苗、酶类 细菌-动物细胞-转基因动物 Date38 乳腺生物反应器具有以下特点： 乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响； 乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器； 一头奶牛一年可生产乳蛋白250300Kg，一只绵羊或山羊 一年可生产乳蛋白2530Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 换成医用蛋白，产量十分可观。 乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品； 在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。 转基因动物生物反应器研制 Date39 转基因动物生物反应器研制 乳腺组织特异表的基因：具milk box保守序列 -乳清蛋白基因 -b乳球蛋白基因 -酪蛋白基因 已开发的产物： -血栓治疗药物（组织型纤溶酶原激活因子) -出血性疾病（凝血因子VIII，IX） -免疫治疗药物（IFN，IL，TNF） -营养制剂(人乳铁蛋白） Date40 人类疾病小鼠模型与基因治疗 癌症-肺癌-p53功能缺陷 遗传病-地中海贫血（临床失败-细胞表达？） AD -对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白 -将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病， 再清除淀粉状蛋白，发现能够减慢甚至停止病情 Date41 药理学研究 胰岛b细胞B7-1转基因小鼠对STZ敏感 阿霉素抗癌，但心脏毒性等副作用大 -金属硫蛋白MT具保护作用 P糖蛋白-肿瘤多药耐药 -knockout mice证实其影响药物的分布与清除 Date42 器官移植 超急性排斥反应 补体激活的阻断-免疫抑制剂危险 补体活性调节因子的负调控 -膜辅助因子MCP -衰退促进因子hDAP/hCD59 1999-猪心猕猴（器官大小） Date43 环境科学研究 生物可利用性的分析只能在活体研究 毒理/环境基因组学 转基因线虫-HSP16/lacZ Date44 转基因小鼠技术的主要问题 外源基因的整合率低 外源基因的表达不理想 成本高 转基因给动物造成 插入突变和机能紊乱 转基因动物成活率低 转基因动物产品的安全性 改善外源基因转移方法 定点整合-cre/loxp 组织特异性启动子 生态/遗传/食品安全 结合动物克隆技术 -Dolly & Polly Date45 Date46 参考文献 现代细胞分子生物学技术-科学出版社，林菊生主编 精编分子生物学实验指南-科学出版社，颜子颖/王海林译 小鼠胚胎操作实验手册-化学工业出版社，孙青原/陈大元译 基因工程小鼠-上海科学技术出版社，傅继梁主编 Transgenic mouse-methods and protocols-MH Hofker & Jan van Deursen Date47 参考文献 （Jackson lab，小鼠基因组资料库） (细胞信号同盟） Palmiter RD, et al., Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature, 1982, 300(5893):611 Gu H, et al., Independent control of immunoglobulin sw