分子生物学研究方法上-2.ppt

第五章 分子生物学研究方法（上） DNA、RNA、蛋白质操作技术 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法， 特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是 分子生物学研究的核心技术。 5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术 本章主要内容： 5.1 重组DNA技术回顾 5.1.1 重组DNA技术诞生的理论基础 5.1.2 关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 5.1.3 重组DNA技术的概念 5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 5.1.5 重组DNA技术的意义 5.1.6 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5.1.7 目的基因的来源 5.1.8 重组实验中的基因载体 5.1 重组DNA技术回顾 40年代明确了遗传的物质基础是DNA 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。 5.1.1 重组DNA技术诞生的理论基础 5.1.2 关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 1、DNA分子的切割与连接技术 限制性核酸内切酶(1972)和连接酶(1967)的陆续发现，才 使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应 5.1 重组DNA技术回顾 Southern印迹结果 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 5.1.3 重组DNA技术的概念 5.1 重组DNA技术回顾 克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 外源基因（目的基因） 载体 工具酶 受体细胞 5.1 重组DNA技术回顾 2、重组DNA技术的基本步骤 目的基因的获得与载体的制备 目的基因与载体DNA的连接 重组DNA分子导入受体细胞 重组体的筛选与重组DNA的鉴定 克隆基因的表达及表达产物的检测与分 离纯化 5.1 重组DNA技术回顾 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒噬菌体病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA目的基因 连接酶 重组体 转化体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交 5.1 重组DNA技术回顾 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 5.1.5 重组DNA技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制， 从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。 5.1 重组DNA技术回顾 酶类功能 限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 DNA聚合酶按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的 缺口 反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合 成DNA链 多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端 末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团 5.1.6 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5.1 重组DNA技术回顾 限制性核酸内切酶 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶.1972年发现第一个内切核酸酶EcoR。 分类: 、 （基因工程技术中常用型） 5.1、 重组DNA技术回顾 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名 Hin d 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 5.1 重组DNA技术回顾 类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列 呈回文对称的序列。 切口 ：平端切口、粘端切口 GGGGA AT TCCCC CCCCT TA AGGGG 5.1 重组DNA技术回顾 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口粘端切口 5.1 重组DNA技术回顾 DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。1967年相继发现。 T4DNA连接酶 EcoR I 连接酶 T7DNA连接酶 5.1 重组DNA技术回顾 n 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 n 基因组DNA文库(genomic DNA library) n cDNA文库(cDNA library) n 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5.1 重组DNA技术回顾 5.1.7 目的基因的来源 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合 从基因组DNA文 库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 碱水解 T T T T 5.1.8 重组实验中的基因载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖 或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 5.1 重组DNA技术回顾 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 5.1 重组DNA技术回顾 载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选 和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一 酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 5.1 重组DNA技术回顾 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个 12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体 黏粒、YAC、BAC ：高容量载体 5.1 重组DNA技术回顾 克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质粒：10kb 噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 5.1 重组DNA技术回顾 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 5.2.3 聚合酶链式反应（PCR）技术 5.2.4 实时定量PCR技术 5.2.5 基因组组DNA文库库构建 在生理条件下，核酸分子之戊糖-磷酸骨架中的磷酸基 团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚 阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁 移。由于戊糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以 同样的速度向正电极方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取 决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用 凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 5.2 DNA基本操作技术 5.2.1 核酸凝胶电泳技术 5.2 DNA基本操作技术 琼脂糖凝胶电泳：分辨力0.250kb （常用） 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力11000bp 核酸分析 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小； 凝胶浓度越大，空隙越小，其分辨能力越强； 反之，凝胶浓度越低，空隙越大，分辨能力越小。 *36 n 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr） 染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外 光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质 中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅 含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地 检测出来。 n 溴化乙锭能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在300nm的紫外线照射下发 出荧光。 5.2 DNA基本操作技术 n 荧光染料：溴化乙锭（EtBr ） 溴化乙锭染 料的化学结构及 其对DNA分子的 插入作用。由于 插入了溴化乙锭 分子，在紫外光 照射下，琼脂糖 凝胶电泳中DNA 的条带便呈现出 橘黄色荧光，易 于鉴定。 5.2 DNA基本操作技术 *40 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于 50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要 用到脉冲电场凝胶电泳。 5.2 DNA基本操作技术 *41 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来 自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗 传改变的生命过程。 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株； 接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 5.2 DNA基本操作技术 5.2 DNA基本操作技术 转化（transformation） ：P163 感受态细胞（Competent cells） ： 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化 学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变 化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于 这种状态下的细胞称 将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获 得新的遗传性状 转导？ 转染？ 感染？ 常用的转化方法： 化学转化（CaCl2）法 电击法 重组DNA分子的体外包装法 5.2 DNA基本操作技术 n 化学转化原理： 将快速生长中的大肠杆菌置于0冷冻处理时， 处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形 ，DNA可吸附于其表面。 在42下做短暂的热刺激下，外源DNA即被细 胞吸收。 将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出 带有外源DNA分子的阳性克隆。 阳性克隆在全培养基中生长一段时间使转化基 因实现表达。 5.2 DNA基本操作技术 n CaCl 2 法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的方法。 n 电击转化：一种高效方法。 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 菌液：生长对数期 场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm 温度：0-4 5.2 DNA基本操作技术 P165 5.2 DNA基本操作技术 重组DNA分子 的体外包装法 5.2 DNA基本操作技术 DNA克隆的筛选： 抗生素抗性基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素 、四环素、链霉素等 -互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养） 5.2 DNA基本操作技术 Antibiotic resistance genes 5.2 DNA基本操作技术 direct selection The procedure to form recombinant DNA -互补筛选 5.2 DNA基本操作技术 n 质粒：携带-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控 序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列。 n 大肠杆菌：携带-半乳糖苷酶（LacZ）羧基端 （C端）部分编码序列。 只有LacZ的N端和C端全部表达，酶才有活性 。 n IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑 蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色） （蓝色） Lac Z（失活） , IPTG X-gal X-gal （白色） （白色） 5.2 DNA基本操作技术 互 补 的 检 测 蓝白斑 5.2 DNA基本操作技术 转化率的计算： 转化体总数菌落数（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积） 插入频率白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 转化频率转化体总数/加入质粒DNA的量（计 算出每微克的转化菌落数） 5.2 DNA基本操作技术 5.2.3 聚合酶链式反应（PCR）技术 1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外 快速扩增特定基因DNA序列的方法 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩 增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引 物，经过变性，退火和延伸若干个循环后， DNA扩增倍数可达2n 倍 5.2 DNA基本操作技术 反应体系 模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序 列互补的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶 dNTP 含有Mg2+的缓冲液 5.2 DNA基本操作技术 PCR的基本反应步骤： 1. 变性：95，模板DNA变性为单链； 2. 退火：50左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：72，DNA聚合酶以dNTP为底物催化 DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25-30次循 环后，可将模板DNA扩增达百万倍。 5.2 DNA基本操作技术 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5 5 5 5 5 5 5 PCR基本反应步骤 5.2 DNA基本操作技术 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 5.2 DNA基本操作技术 PCR技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆， （2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆； （3）制备DNA探针，进行分子检测等。 5.2 DNA基本操作技术 PCR反应中，当引物模板与DNA聚合酶达到一定比值 时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效应” ，即PCR反应产物不再增加。 定量PCR与定性PCR测定 最根本的区别最根本的区别 定量定量PCRPCR定性定性PCRPCR 测测测测定点定点指数扩扩增期扩扩增的平台期 5.2 DNA基本操作技术 5.2.4 实时定量PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过 动态监测反应过程中的产物量，消除了 产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为 定量PCR。20世纪90年代末期出现。 实时荧光定量PCR PCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质 ，对每一个循环产物荧光信号的实时检测 可以得到荧光扩增曲线 实现对起始模板定量和定性分析 5.2 DNA基本操作技术 两种定量化学 5.2 DNA基本操作技术 荧光染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 与DNA双链结合时发光 游离时不发光 5.2 DNA基本操作技术 PCR过程中荧光染料的掺入：信号强度与双链DNA 分子数正比。激发光波长520nm。 5.2 DNA基本操作技术 染料的特点 5.2 DNA基本操作技术 Taqman探针 一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列扩增有关。 探针5端连接荧光(报告)基团，3端连接淬灭基团。 PCR延伸反应时，利用DNA聚合酶的5 3外切酶 活性，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光信号。 5.2 DNA基本操作技术 5端连接荧光基团 中段特异碱基序列（50-150bp） 3端连接淬灭基团 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 5.2 DNA基本操作技术 n 实时荧光定量PCR技术原理 n 实时荧光定量PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引 物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 5.2 DNA基本操作技术 分子信标 TaqMan探针的衍生物 发夹型杂交探针 形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针 发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。 利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开。 5.2 DNA基本操作技术 探针的特点 5.2 DNA基本操作技术 方法优优点缺点适用范围围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现现非特异 性带带 不能进进行多重 定量 适合科研中对对各种目 的基因定量分析，基 因表达量的研究，转转 基因重组动组动 植物的研 究 TaqMan 方 法 特异性高 重复性好 多重定量 价格高 只适合特定目 标标 病原体检测检测 ，疾病耐 药药基因研究,药药物疗疗 效考核 遗传遗传 疾病的诊诊断 不同实时定量方法的比较 5.2 DNA基本操作技术 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) n 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部 DNA序列的克隆群体。 5.2 DNA基本操作技术 5.2.5 基因组DNA文库构建 基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组 DNA的信息（包括所有的编码区和非编 码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体 。 用于构建基因组文库的载体有噬菌 体、粘粒和酵母人工染色体等。 5.2 DNA基本操作技术 n基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 体外包装噬菌体 5.3 RNA基本操作技术 5.3.1 总RNA的提取 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 5.3.5 基因文库的筛选 5.3 RNA基本操作技术 5.3.1 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多 种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫 氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白 质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽 提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后 可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋 白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层 （黄色）主要为DNA和蛋白质。 收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA。 DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA 33g/ml 单链DNA 判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 1.8-2.0 u OD260的应用 5.3.2 mRNA的纯化 5.3 RNA基本操作技术 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析 法最为有效，已成为常规方法。 利用mRNA的Poly A结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚 dT引物，与Poly A杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂 交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用，形成抗 生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化 寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以 磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度 盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT 引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。 *85 PolyATtract mRNA的分 离纯化过程 简图 5.3 RNA基本操作技术 5.3.3 cDNA的合成 5.3 RNA基本操作技术 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA， 有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引 物是oligo dT。 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 cDNA文库是包含某一组织细胞在一 定条件下所表达的全部mRNA经逆转录 而合成的cDNA序列的克隆群体，它以 cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的 基因表达信息。 5.3 RNA基本操作技术 5.3.4 cDNA文库的构建 cDNA文库(complementary DNA library)以 组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成 双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形 成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这 些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库 。 5.3 RNA基本操作技术 l cDNA文库构建基本程序： 构建步骤： 1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素 2、反转录生成cDNA: 反转录酶，olig(dt) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装 5.3 RNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 *92 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库 中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程 。 筛选方法有很多种，常用的有： 核酸杂交法：广泛的 适用性和快速性。 PCR筛选法：前提是 获得基因的特异性引物。 免疫筛选法：适用于 表达文库的筛选。 5.3.5 基因文库的筛选 5.3 RNA基本操作技术 DNA探针： 带有特殊碱基 序列的单链DNA 或RNA分子,可 以用放射性物 质或免疫性物 质标记,通过杂 交,检查样品。 DNA探针常用于 检测互补的碱 基序列。 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.4.1 SNP概述 5.4.2 SNP的检测技术 5.4.3 SNP的应用 5.4.1 SNP概述 SNP（single nucleotide polymorphism）即单 核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单 个核苷酸的突变而引起的多态性。 在人类基因组发生的频率可达1%或更高 。 每300-1000个bp就有一个SNP。 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核 苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换 5.4 SNP的理论与应用 SNP分类： 5.4 SNP的理论与应用 1、根据SNP在基因组的位置分三种： 基因编码区SNP：变异率较少，占1/5。 基因调控区SNP：会影响基因表达量的多少。 基因间随机非编码区SNP 2、根据对生物遗传性状的影响分两类： 同义SNP：不影响氨基酸的翻译。 非同义SNP：改变氨基酸序列，影响蛋白质功能。 u SNPs的研究意义 1.SNPs作为第三代遗传标记（已知性、 可遗传性、可检测性），用于疾病基因 的定位、克隆和鉴定。_路标的作用 5.4 SNP的理论与应用 2. 基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、 病理条件下的千差万别） u SNPs研究进展和方向 1. SNPs数据库的构建发现 2. SNPs功能的研究（在1的基础上） 5.4 SNP的理论与应用 1. 理想的检测检测 SNP的方法 发现发现 未知的SNP，或检测检测 已知的SNP (1) 灵敏度和准确度的要求（反应应原理严紧严紧 ） (2) 快速、简简便、高通量 (操作和分析的自动动化程度高） (3) 费费用相对对低廉 5.4 SNP的理论与应用 5.4.2 SNP的检测技术 3.每种SNP的检测方法都由两部分组成: 区分SNPs特异位点的原理方法 数据的检测分析手段 5.4 SNP的理论与应用 2. 现状： 到现在还没有一个符合以上条件的理 想方法出现, 但根据实际情况,可以选择 出较合适方法。 SNP检测方法的分类 u 区分SNP 特异位 点的原理方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法 u 数据检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3.DNA 芯片 4.质谱检测技术 5.4 SNP的理论与应用 5.4 SNP的理论与应用 5.4.3 SNP的应用 1、人类基因单体型图的绘制 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导用药与药物设计 4、遗传病研究、动植物遗传育种 *103 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone ）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体 组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子 （monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞 （progenitor cell）分裂而来的一群带有完全相同遗传 物质的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力 的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为 克隆。 5.5 基因克隆技术 概述： 5.5 基因克隆技术 5.5.1 RACE技术 5.5 基因克隆技术 5.5.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 5.5.3 Gateway 大规模克隆技术 5.5.4 基因的图位克隆 5.5 基因克隆技术 5.5.1 RACE技术 是一种在已知cDNA序列的基础上，快速克隆 3或5 端缺失序列的技术； 是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，用 PCR技术扩增出某个特异位点到3或5 端之 间未知序列的方法。 RACE：rapid amplification of cDNA ends *106 RACE技术 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已 知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进 行PCR扩增得到目的序列。 用于扩增5端的方法称为5RACE; 用于扩增3端的称为3RACE。 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差 法显示和基因文库筛选。 5.5 基因克隆技术 *107 5 RACE 在反转录酶作用下，以已知基 因片段内部特异性引物启始 cDNA第一条链的合成 RNase混合物降解模板 mRNA，纯化cDNA第一条链 。 用末端转移酶在cDNA链3端 加入连续的dCTP 以连有oligo(dG) 的锚定引物 和基因片段内部特异的nested 引物进行PCR扩增，以期得到 目的片段，并可用nest PCR 进行检测。 5.5 基因克隆技术 *108 3RACE 是在反转录酶的作用下，以连 有可以和polyA配对的 oligo(dT)的锚定引物启始 cDNA第一条链的合成。 用RNaseH 降解模板mRNA 。 用通用锚定引物和基因片段内 部特异引物进行PCR扩增得到 目的3片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩 增。 5.5 基因克隆技术 mRNA的获取 去磷酸化 加寡聚接头（5） 反转录合成第一条cDNA 5RACE，扩增5未知序列 3 RACE扩增3未知序列 5已知的接头序列； 基因特异反向序列 3寡聚dT下游序列； 基因特异反向序列 5.5 基因克隆技术 5.5.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 差减杂交与RT-PCR方法相结合，以指 数形式扩增双链DNA模板，以线性形式 扩增单链DNA模板，通过降低cDNA群 体复杂性和更换cDNA两端接头等方法 ，特异性扩增目的基因片段 5.5 基因克隆技术 cDNA-RDAcDNA差示分析法： 5.5 基因克隆技术 mRNA逆转录为cDNA ，用4碱基识别酶消 化，与接头1连接， PCR 扩增；去除接 头1，扩增子接上接 头2，与驱逐子杂交 ，PCR扩增；去除接 头2，加上接头3， 再与driver杂交， 再扩增，筛选出目 的片段、克隆、测 序。 cDNA-RDA主要步骤: *112 v相对酶切构建载体来说 ，该技术具有需时短、操 作简单、易于各实验室交 流的特点，即只需通过简 单、高效的BP 和LR 反应 就可实现把PCR 产物定向 转入克隆质粒和表达质粒 ，实现PCR 产物在各种质 粒间的平行转移。 5.5.3 Gateway 大规模克隆技术 5.5 基因克隆技术 *113 所有具有某种表现型的基因都可通过该法克隆得到。首先 ，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特 定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标 记。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针 的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色 体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离 出来 5.5.4 基因的图位克隆法 （Map-based cloning） 5.5 基因克隆技术 1986年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的 ， 无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达 产物的有关信息，但必须建立遗传分离群体. 主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆. 5.5 基因克隆技术 基因的图位克隆法 （Map-based cloning） 1、将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并 在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记 2、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作 探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记 之间的基因片段克隆并分离出来 3、鉴定目的基因 步骤: 5.3 基因克隆技术简介 染色体步移： 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的 DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克 隆是“一步克隆”，利用获得的克隆作探针对 文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复 序列的阳性克隆