分子生物学第七章DNA的重组与转座.ppt

第七章 DNA的重组与转座 7.1 同源重组 7.2 位点特异性重组 7.3 转座作用 7.4 逆转录转座子 广义上，任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗 传重组（genetic recombination）. 狭义上，指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ，有时又称交换（crossing over）. 通过不同个体间的基因交换，可以保证遗传的多样性 ，从而为选择奠定物质基础。 遗传重组包括同源重组，位点专一性重组，转座重组 和异常重组。 7.1 同源重组(homologous recombination) 一、定义：同源重组也称交换，指减数分裂过程中 染色体间遗传物质的交换，即在两个双螺旋DNA分子中 任何一对同源序列作底物进行交换。 同源重组发生在DNA 的同源序列之间。在生物细胞中 很普遍，如真核生物非姊妹染色体之间的交换，姊妹染 色体的交换，细菌及其某些低等真核生物的转化、转导 、接合等都属于同源重组。 同源重组的机制 （一）、断裂复合 ： 减数分裂中， 染色体减数分裂和配 对时，在染色单体水 平上发生物理断裂， 断裂可通过交叉重接 而解除张力，从而产 生两个相互重组的染 色单体。 （二）重组过程:由Holliday 提出，后经Messelson， Radding修改，可以分为以下 几个步骤. 1、切断（nicking）：同源联 会的两个DNA分子中任意一个 出现单链切口（由某些DNA内 切酶产生）。 2、链转换（strand displacement）：切口处形成 5端局部解链，由细胞内类似 于大肠杆菌DNA Pol I的酶系 利用切口处的3-OH合成新链 ，而把原有链转换出来，使原 有链成为游离的5-单链区段 。 3、单链侵入（single-strand invasion）由链置换产生的 单链区段侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生 的单链泡中。 4、Loop切除：侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子 中的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出 来，由此产生D-Loop，其单链区随后被切除降解。 5、链同化（strand assimilation ）Loop切除中产生的3- OH断头和侵入的单链的5-P由DNA Ligase联接，同时侵入的单 链沿5-3方向继续置换，Loop切除中产生的5-P断头。 6、异构化：链同化过程中，DNA经过一定的扭曲旋转形成的 异构体。 7、分支迁移（branch migration）：两条DNA分子之间形成 的交叉点可以沿DNA移动，这一过程称为分支迁移。 图、分枝迁移 Holliday结构的拆分 重组体连接两个DNA双链的 交换中间物含有4股DNA链，在 其连接处为转换配对所形成交 叉链的连接点称为Holliday结 构。该结构中由二对连锁在一 起的DNA分子组成。 Holiday中间体的形成只完 成了重组的一半，由于连锁在 一起的两条DNA分子必须经过拆 分（resolution）回复到彼此 分开的双螺旋状态。拆分的方 式有两种，需要内切酶在交叉 点处形成一对切口，然后由连 接酶连接。 细菌DNA的重组 1、细菌重组酶： 1）RecA蛋白：为E。coli RecA基因的产物，RecA蛋 白是催化重组基本反应的酶，能通过碱基配对使两个 DNA连接成杂交分子。 2）Rec BCD酶：亦称核酸外切酶V，它通过Chi序列 识别靶位点。该酶具有多种活性，可以在单链结合蛋白 的存在下松开DNA双链，同时还具有ATP酶活性，它在 重组中的作用是提供具有3-末端的单链区域。 3）ruvABC：其中ruvA和B基因产物可促进异源双链 结构的形成。 1、单链摄入和链交换 RecA蛋白作用于DNA分子，用单链去置换双链分子的同源 区段，这个反应称单链摄入。RecA蛋白的这种作用是通过与游 离的单链3-端结合，并引导单链DNA侵入双链DNA中，这种作 用还需要RecBCD的协助。 E.coli中有一种ChiKai结构： 5-GCTGGTGG-3 3-CGACCACC-5 RecBCD沿双链滑行至Chi结构 附近时，将其附近的兔耳结构 的一端切开形成具有3-端的 单链区，RecA再与此单链DNA 的3-端结合并引入另一双链 结构中导致重组，RecBCD则沿 双链继续寻找下一个Chi结构 。 兔耳结构：RecBCD结合 DNA，使解链速度大于恢复双 螺旋的速度，所以形成二个单 链环，称兔耳结构。 同源重组的作用 1、维持种群的遗传多样性 2、在真核生物中同源重组使同源染色体的染色单体间发生 物理连接，这样使第一次减数分裂时同源染色体能平均分配至 子代细胞中。 3、有助于DNA损伤的修复，发生重组的位置常含有错配的 碱基。 7.2 位点专一性重组 特指噬菌体DNA整合到细菌染色体DNA的过程。最早在 phage的遗传学研究中发现的，DNA通过重组整合到大肠杆菌染 色体的专一性位点上，转变为原噬菌体DNA的非活性状态（溶源 状态）。在溶菌状态时，DNA以环状分子独立存在，两种状态的 转换都与位点专一性重组有关。位点专一性重组不是由DNA序列 的同源性所引起，仅涉及短的同源序列。 整合和切除过程是在细 菌DNA和噬菌体DNA专一的附着位点（attachment site , att） 上 进行的， 细菌的附着位点称attB， 由序列BOB组成，噬菌体的附 着位点称attP，由序列POP组 成，其中O序列为attB和attP所 共有，称为核心序列。重组就 发生在这段序列上。 在重组过 程中DNA以线性形式插入细菌 染色体，此时原噬菌体被重组 产生的两个新的att（attL， attR）位点所固定，整合过程 在attB和attP之间识别，而切 除过程在attL和attP之间识别 。 Figure . Does recombination between attP and attB proceed by sequential exchange or concerted cutting? Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites Figure 14.21 Staggered cleavages in the common core sequence of attP and attB allow crosswise reunion to generate reciprocal recombinant junctions. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites Figure . Recombination between two paired duplex DNAs could involve reciprocal single-strand exchange, branch migration, and nicking. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites Figure . Int and IHF bind to different sites in attP. The Int recognition sequences in the core region include the sites of cutting. Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites Site-specific recombination: ( 位点专一重组） Antibody diversity H and L are all encoded by three gene segments: V, D, J V-39bp 28-D- 28 39bp- J Two heavy chains (H) 250155 Two light chains (L) 2504 Enormous number (108) of different H and L gene sequences can be produced by such a recombination One antibody example produced by site-specific recombination 7.3 转座重组 同源染色体上的重组比例较少，较多的还是非同源染色体间的转 座重组。 原核生物，真核生物基因组中都有一些不必借助同源序列可以从 一个部位移动到另一个部位的DNA片段，这些片段称转座子（ transposon or transposable element）。转座作用与供体和受体 部位之间的序列没有任何关系。 所有的转座子都有两个结构特征：其一两端有20-40bp的反向重 复序列；其二转座子的中间具有编码转座酶的基因，这种酶催化转 座子插入新的位置。 转座子的共性：1、两端都有反向重复序列 2、具有编码转座酶的基因，催化转座子插入新的位点 原核生物的转座 （一）转座子的类型和结构特征 1、简单转座子，即插入序列（insertion sequence, IS） 。IS在大肠杆菌的质粒中很常见，如IS1有10个拷贝，IS可编码 转座酶，是自主单位。 5-GAC-CAG-3 IS的共性： 1、IS的末端为反向重复序列，15-20bp，二者可以不完全 相同。 2、IS转入宿主DNA序列时，使宿主DNA产生同向重复序列， 靶位点长度一般为5-9bp，形成5-9bp的同向重复。 Transposition ( 转座作用） IS element 转座酶 在宿主 DNA上 切割 IS插入缺口后 形成同向重复 2、复合转座子：较大，由两个重复序列夹着中心区的编码 其他蛋白如抗药性基因组成，通常以Tn命名。复合转座子的重 复序列就是IS，可从一个位点转座到另一个位点，或从一个复 制子转座到另一个复制子。 （二）转座子的转座机制 转座子都是具有编码与转座作用有关的酶转座酶 ，而转座子的末端大多数都是反同重复序列。其转座机制为： 在转座酶的作用下，在转座子两端和靶位点产生切口，所形成 的突出单链末端与转座子两端 的反向重复序列相连，然后由 DNA聚合酶填补缺口，连接酶封闭切口。 转座作用的机制分为三种类型： 复制型转座：留一个，转一个 非复制型转座：直接转移 保守型转座：为另一种非复制型转座，转 座过程中，转座子从供体位点切除，插入到 靶位点，其中每一个核苷酸都被保留下来。 Figure Mu transposition generates a crossover structure, which is converted by replication into a cointegrate . 1、Replicative transposition proceeds through a cointegrate Figure Nonreplicative transposition results when a crossover structure is released by nicking. This inserts the transposon into the target DNA, flanked by the direct repeats of the target, and the donor is left with a double -strand break. 2、 Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion Figure 15.6 Nonreplicative transposition allows a transposon to move as a physical entity from a donor to a recipient site. This leaves a break at the donor site, which is lethal unless it can be repaired. Transposition occurs by both replicative and nonreplicative mechanisms Figure Both strands of Tn10 are cleaved sequentially, and then the transposon is joined to the nicked target site. Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion . （三）转座子转座频率的控制 对于细胞来说，控制转座子调换的频率是很重要的，为了自下 而上，转座子必须能维持某一最小的移动频率，但是太大的频 率会破坏宿主细胞，每一个转座子好像都有控制它自身调换频 率的机制，机制的多样性通过Tn10被描写。 Tn10为复合型转座子，两端 各有一重复序列 5NGCTAGCN3 3NCGATCGN5 IS10R是Tn10的活性组件， IS10L是功能缺陷型，其转 座酶的活力是IS10R的1- 10%，靠近IS10R有两个方 向相反的启动子。 1、 甲基化控制：Tn10上有二个甲基化位点（GATC）， 一个位于IS上，另一个位于转座子的转座酶启动子上。 Tn10与宿主DNA 一起复制时，产生半甲基化，转座子激 活，编码出转座酶，导致转座，一旦两个位点均被甲基 化，则转座酶停止合成，转座停止。 GATCGATC 2、 通过启动子调节：Tn10上有二个方向相反的启动子 ，向外的启动子较强，称Pout，转录产物为一短链RNA， 向内的启动子Pin较弱，转录产物为一个有编码区段的 RNA，可翻译出47KD的转座酶，两种转录产物RNA之间有 40bp的重叠，可结合从而抑制转座酶的表达。 . （四）转座子引起的某些遗传学效应 引起插入突变 插入位置上出现新的基因 插入位置出现靶DNA的少数核苷酸对重复 导致染色体畸变 切除，转座子从原来的位点上消失。 真核生物的转座作用 较清楚的是果蝇的P成分，玉米的Ac-Ds元件 1 玉米的转座成分 玉米中存在几组控制元件：Ac-Ds，spm， Dt等，不同品系中其数 目和位置不同。较清楚的是 Ac-Ds元件，其中Ac是自主成分，Ds是非自主成分。Ac是一个 Figure The Ac element has two open reading frames; Ds elements have internal deletions. Controlling elements in maize form families oftransposons 完整的转座子，长 4563bp，可转录出 3600bp的mRNA，含807 个密码子序列，在编码 序列两侧有11bp的反向 重复序列，Ac具有转座 酶基因，可以自主移动 ，它能引起较高回复频 率的突变，Ac突变可导 致玉米合成花色素苷。 Ds元件是在转座酶基因上有缺失的Ac元件 ，在Ac成分的激活下，Ds成分可以转座到新的 靶位点，使靶位点处的基因失活，改变基因的 表达活性，Ds突变能引起稳定的突变，产生无 色的玉米粒。 2 果蝇中的P元件 果蝇中两个品系P型和M型 杂交时，会出现： P雄+M雌 后代不育 P雌+M雄 后代可育 P品系中有P因子，M品系中 无。P元件长度是变化的， 但序列同源，最长P元件长 约2.5 Kb，有四个与转座 作用有关的可译框（ORF） 。P元件的两侧有31bp的反 向重复序列，在靶位点上 形成8bp的正向重复。 P元件在体细胞中，仅前两 个内含子0、1可被剪切，外 显子2和3 不发生剪接，产 生的mRNA为ORF0-ORF1-ORF2 ，编码66KD的蛋白，为转座 酶的抑制物。 P元件在卵细胞中，可剪切 除去0、1、2、和3个内含子 ，将全部4个外显子剪接在 一起，mRNA的翻译产物为 87KD的转座酶，致命P元件 发生转座，使配子细胞不育 ，导致后代不育。 在卵细胞中有细胞质，精细胞几乎无细胞质，卵细胞中早 已充满了转座酶的阻遏物，固P品系的雌果蝇与任何品系 的雄果蝇杂交，后代全都可育，而M品系中，由于卵细胞 中无完整的P成分，也就无转座酶的抑制物，当其与P品系 的雄果蝇杂交时，P成分被激活，表达出转座酶产生转座 ，导致配子不育，使后代不育。 逆转录作用（reverse transcription ） 1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒 和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录 酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。 定义: 以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合 成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。 7.4 逆转录转座子 将从DNADNA的转移过程称转座，从 DNARNADNA的转移过程叫逆转录转座。 逆转录转座子特性：与高频自发突