分子生物学原理--RNA的生物合成.ppt

第 十 一 章 RNA的生物合成 （转录） RNA Biosynthesis, Transcription Date分子生物学原理 转 录 RNA DNA 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 也就是把DNA的碱基序列抄录成RNA的 碱基序列。 Date分子生物学原理 复制与转录的异同点 相同点： 不同点: 复制 转录 以DNA作模板 双链复制 模板链 需4种NTP dNTP NTP 碱基配对 A=T A=U,T=A 合成方向53 依赖DNA的聚合酶 DDDP DDRP 多聚核苷酸大分子 半保留式子代 mRNA、 tRNA、rRNA Date分子生物学原理 参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子 Date分子生物学原理 模板和酶 Templates and Enzymes 第一节 Date分子生物学原理 一、转录模板 结构基因：strucural gene 能转录出mRNA然后指导蛋白质生成 的部分。 模板链：template strand 可作为模板转录成RNA的一股链。也 称作有意义链或Watson链。 编码链：coding strand 相对于模板链的另一股链。也称为反 义链或Crick链。 Date分子生物学原理 模板: 转录、翻译的序列比较 5 GCATTAGCTAGCTACTAGC 3 DNA 3 cgtaatcgatcgatgatcg 5 双链 转录 5 GCAUUAGCUAGCUACUAGC 3 mRNA 翻译 N AlaLeuAlaSerTry C 肽链 Date分子生物学原理 转录的不对称性 不对称转录：asymmetric transcription DNA双链对一个基因而言，一股可转录 ，另一股不转录。 模板链与编码链相对而言 Date分子生物学原理 5 3 3 5 模板链编码链 编码链模板链 结构基因 转录方向 转录方向 Date分子生物学原理 二、 RNA聚合酶 转录酶：依赖DNA的RNA聚合酶 DNA dependent RNA polymerase DDRP Date分子生物学原理 原核生物的RNA聚合酶 大肠杆菌的RNA聚合酶：2 其中2称为核心酶：只有转录功能 亚基：辨别转录起始点 +2=全酶 受利福平或利福霉素（结核菌药物）的特异 性抑制。 Date分子生物学原理 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme) Date分子生物学原理 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 Date分子生物学原理 原核生物的RNA聚合酶 Date分子生物学原理 真核生物的RNA聚合酶 RNA聚合酶II可认为是真核生物中最重要的RNA聚合酶 Date分子生物学原理 三、模板与酶的辨认结合 原核生物一个转录区段可视为一个转录单 位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因 及其上游(upstream)的调控序列。 5 3 3 5 结构基因调控序列 RNA-pol RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启 动子(promoter)。 Date分子生物学原理 三、模板与酶的辨认结合 启动区的保守序列 原核生物有两个元件 -35bp的辨认位点：5-TTGACA- -10bp的Pribnow盒: 5-TATAATPu 真核生物有多个元件(如-30的 Hogness或TATA盒)。 Date分子生物学原理 RNA聚合 酶保护法 目 录 Date分子生物学原理 开始转录 T T G A C A A A C T G T -35 区 (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py -10 区 1-30-5010-10-40-20 5 3 3 5 原核生物启动子保守序列 RNA-pol辨认位点 (recognition site) 5 5 RNA聚合酶保护区结构基因 3 3 Date分子生物学原理 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件 结构基因 -GCGC-CAAT-TATA 转录起始 真核生物启动子保守序列 Date分子生物学原理 转录过程 The Process of Transcription 第二节 Date分子生物学原理 （一）转录起始 转录起始需解决两个问题： 1. RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的 起始区域。 2. DNA双链解开，使其中的一条链作为转录 的模板。 一、原核生物的转录过程 Date分子生物学原理 2. DNA双链解开 1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应， 形成转录起始复合物 RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 转录起始复合物: 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi 转录起始过程 Date分子生物学原理 转录起始中的事件 解链 形成转录空泡 为首的为三磷酸GTP或ATP 转录起始复合物(RNA-聚合酶全酶-DNA- pppGpN-OH) 第一个磷酯键形成后， 亚基从转录起始 复合物中脱落下来。RNA聚合酶沿DNA 链向前移动。 Date分子生物学原理 转录空泡(transcription bubble)： RNA-pol （核心酶） DNA RNA Date分子生物学原理 （二）转录延长 1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构， 与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链 不断延长。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi Date分子生物学原理 转录的延长 转录的延长是以5到3的方向进行的。 (NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi 以G=C、A=U、T=A碱基配对。 转录完成部分的DNA重新形成双链。 较长的RNA链上有核糖体结合，说明在 某些情况下，转录的同时，翻译已经开始 进行了。 Date分子生物学原理 Date分子生物学原理 转录的过程 Date分子生物学原理 转录的延长 Date分子生物学原理 5 3 DNA 原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 Date分子生物学原理 （三）转录的终止 转录终止：是RNA聚合酶在模板上的某 一位置停顿，RNA链从转录复合物上脱离 出来。 分为依赖Rho因子的转录终止和不依赖 Rho因子的转录终止。 Date分子生物学原理 1、依赖Rho因子的转录终止 Rho因子的 左右是使 RNA-DNA 杂化双链的 短链变性， 从而有利于 转录产物从 转录复合物 中释放出来 。 Date分子生物学原理 A T P 1. 依赖 Rho因子的转录终止 Date分子生物学原理 2. 非依赖 Rho因子的转录终止 DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱 基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊 的结构来终止转录。 Date分子生物学原理 2、非依赖Rho因子的转录终止 Date分子生物学原理 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUU. UUUU. 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构 Date分子生物学原理 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。 5pppG 5 3 3 5 RNA-pol Date分子生物学原理 不依赖Rho因子的转录终止模式 RNA链出现茎-环结构，促进 转录的终止。 1.这样的结构改变RNA聚合酶 的构象，使酶不再向下移动。 2.DNA和RNA各自形成自己的 局部双链，使杂化链更加不稳 定，以致转录复合物趋于解 体。 接着的一串寡聚U，则更是促 进RNA新链从模板上脱落的 促进因素。 Date分子生物学原理 二、真核生物的转录起始 （一）转录起始 真核生物的转录起始上游区段比原核生物 多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模 板，其起始过程比原核生物复杂。 Date分子生物学原理 转录起始点 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件(cis-acting element) 1. 转录起始前的上游区段 AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内 含 子 OCT-1 OCT-1：ATTTGCAT八聚体 Date分子生物学原理 2. 转录因子 能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反 式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA 聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 Date分子生物学原理 参与RNA-pol转录的TF Date分子生物学原理 3. 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结 合，而需依靠众多的转录因子。 Date分子生物学原理 POL- TFF A B 由RNA-Pol 催化转录的PIC POL- TFF H E TBP TAF TFD-A-B-DNA复合物 TATA A B TBP TAF TATA H E CTD-P PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化 Date分子生物学原理 4. 模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转 录因子。转录因子之间互相结合，生成有活 性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭 配而有针对性地结合、转录相应的基因。 Date分子生物学原理 （二）转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相 似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的 现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和 解聚现象。 Date分子生物学原理 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小体转 录 延 长 中 的 核 小 体 移 位 转录方向 Date分子生物学原理 5-AAUAAA- 5 -AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol AATAAA GTGTGTG 转录终止的修饰点 5 5 3 3 3加尾 AAAAAAA 3 mRNA （三）转录终止 和转录后修饰密切相关。 Date分子生物学原理 真核生物转录终止的特点 真核生物mRNA带有聚腺苷酸尾巴的结 构，这是转录之后加上的。 在模板链读码框架的3端之后，常有一 组共同序列AATAAA，再下游还有相当 多的GT序列，这些序列称为转录终止的 修饰点。 Date分子生物学原理 转录与复制的相似之处 都以DNA为模板 需要核苷酸作原料，从5到3延长；生成 磷酸二酯键以连接核苷酸 都遵从碱基配对规律 都需要依赖DNA的聚合酶 产物都是很长的多核苷酸 Date分子生物学原理 转录和复制的区别 Date分子生物学原理 真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification 第三节 Date分子生物学原理 转录后的修饰 转录生成的RNA，称为初级转录产物。 无论在真核生物或原核生物中，初级转 录产物都经过一定程度的修饰加工，才能 表现其功能。 Date分子生物学原理 几种主要的修饰方式 1. 剪接(splicing)2. 剪切(cleavage) 3. 修饰(modification)4. 添加(addition) Date分子生物学原理 一、真核生物mRNA的转录后加工 （一）首、尾的修饰 5端形成 帽子结构(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail) Date分子生物学原理 帽子结构 Date分子生物学原理 5 pppGp 5 GpppGp pppG ppi 鸟苷酸 转移酶 5 m7GpppGp 甲基转移酶 SAM 帽 子 结 构 的 生 成 5 ppGp 磷酸酶 Pi Date分子生物学原理 真核生物mRNA的转录后加工 5和3首尾的修饰 剪接 Date分子生物学原理 5加帽 转录产物的第一个核 苷酸pppG水解成5- ppG或5-pG 与另一个三磷酸鸟苷 生成三磷酸双鸟苷 第二个鸟嘌呤被甲基 化 加帽出现在hnRNA中 ，说明可能在细胞核中 完成，并在剪接之前。 Date分子生物学原理 3端加上聚腺苷酸尾巴 真核生物mRNA中poly A的出现是不依赖于 DNA模板的。 加入poly A之前，先由核酸外切酶切去3末 端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA。 3端修饰也是在细胞核中，在剪接之前进行 的。 Poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻 译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定 性。 Date分子生物学原理 3端修饰示意图 Date分子生物学原理 （二）mRNA的剪接 1. hnRNA 和 snRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero- nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA) 核内的蛋白质 小分子核糖核酸蛋白体 （并接体, splicesome） snRNA Date分子生物学原理 真核生物结构基因，由若干个编码区和非 编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非 编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成 的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。 断裂基因(splite gene) CABD 编码区 A、B、C、D 非编码区 Date分子生物学原理 2. 外显子(exon)和内含子(intron) 外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现， 并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被 除去的核酸序列。 Date分子生物学原理 鸡卵清蛋白 基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 鸡 卵 清 蛋 白 基 因 及 其 转 录 、 转 录 后 修 饰Date分子生物学原理 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图 DNA mRNA Date分子生物学原理 真核细胞mRNA的剪接 DNA模板与 hnRNA是完全配 对的，而成熟的 mRNA与hnRNA 或DNA杂交都只 是部分配对。 因此真核生物的 基因有断裂性。 Date分子生物学原理 断裂基因 真核生物的结构基因，由若干个编码区被非 编码区相互间隔开，但又连续镶嵌而成，因 此真核生物的基因称为断裂基因。 外显子代表了基因上编码氨基酸的核苷酸序 列。 内含子表示相应的非编码序列。 原核生物结构基因是连续的编码序列，不是 断裂基因。 Date分子生物学原理 内含子的种类 线粒体，叶绿体转录初级rRNA基因 线粒体，叶绿体的mRNA 形成套索状结构的剪接，由SnRNA和核 内蛋白形成的核小核糖核酸蛋白来完成。 tRNA基因。 Date分子生物学原理 3. 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含 子分为4类。 I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真 核生物的 rRNA基因； II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是 mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数 mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内 含子，剪接过程需酶及ATP。 Date分子生物学原理 4. mRNA的剪接 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。 snRNP与hnRNA结合成为并接体 Date分子生物学原理 UACUACA - AG UG U4 U5 U6 E1 E2 U1U2 UACUACA - AG UGU6 E1 E2 U1、U4、U5 Date分子生物学原理 pG-OH (ppG-OH, pppG-OH) U-OH GpUpGpA 第一次转酯反应 第二次转酯反应 UpAGpU 外显子1 内含子 外显子2 G-OH UpU pGpA 剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification) Date分子生物学原理 RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录 后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分 化加工(differential RNA processing)。 5. mRNA的编辑(mRNA editing) 人类apo B基因 mRNA（14500个核苷酸） 肝脏 apo B100 （分子量为500 000） 肠道细胞 apo B48 （分子量为240 000） mRNA编辑 Date分子生物学原理 内含子的功能 内含子有利于物种的进化选择 调节功能 Date分子生物学原理 tRNA的转录后加工 初级产物中有5端的16个碱基和反密码 子后的14个碱基需要去除。 Date分子生物学原理 二、tRNA的转录后加工 tRNA前体 RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCC DNA Date分子生物学原理 RNAaseP、 内切酶 Date分子生物学原理 tRNA核苷酸转移酶、 连接酶 ATP ADP Date分子生物学原理 碱基修饰 （2）还原反应 如：U DHU （3）核苷内的转位反应 如：U （4）脱氨反应 如：A I 如：A Am （1）甲基化 （1） （1） （3） （2） （4） Date分子生物学原理 涉及加工的反应 甲基化 还原 核苷内的转 位反应 脱氨反应 3端加上 CCA-OH Date分子生