毕业论文茶多糖提取工艺的优化.doc

毕业论文题目： 茶多糖提取工艺的优化 专 业： 药学 方 向： 药物化学 目录论文正文1 中文摘要1 英文摘眼1 前言2 实验部分3 结果与分析6 问题与讨论13 结论14 参考文献15 致 谢16课题任务书17外文翻译21文献综述36开题报告43茶多糖提取工艺的优化摘要 目的：本文以粗茶为主要原材料进行茶多糖提取工艺的研究。方法：采取水提醇沉法，对茶叶中的茶多糖进行提取分离，然后运用苯酚-硫酸法测定茶多糖的含量。本文重点以pH值对茶多糖提取率的影响进行了探讨，在单因素实验结果的基础上，考察了pH值、浸提温度、浸提时间以及乙醇浓度四因素对茶多糖提取率的影响，采取L9(3)4 的正交实验设计，通过极差分析，得到茶多糖提取的最佳条件组合。结果：对茶多糖提取率影响最显著的因素为浸提温度，其次为乙醇浓度、浸提时间、pH值，茶多糖的最佳提取工艺条件为pH值为4、浸提温度为85C、浸提时间为1.5h、乙醇浓度为75%，茶叶中茶多糖的平均含量为2.67% 。结论：采用上述浸提工艺，既可以节省提取工艺的成本，也可以提高提取工艺的效率，并能最终为粗茶的综合利用提供社会经济效益的新途径。关键词 茶多糖；提取；正交试验；最佳工艺条件；平均含量Optimization Technological Extraction of Tea PolysaccharideAbstract Purpose: This text is studying the preparation procedure for extracting polysaccharide based on the rough tea. Method: To adopt water extraction alcohol precipitation method, isolate and purify the polysaccharide from the tea, and then use phenol-sulfuric acid method to determine the content of Tea polysaccharide. In this paper, pH value work on Tea polysaccharide extraction yield is studied on the key point. Based on the results of the single factor experiment, make an on-the-spot investigation of the pH value、lixiviating temperature、lixiviating time and the ethanol concentration four factors working on Tea polysaccharide extraction yield, take L9(3)4 orthogonal design, through analysis of range, optimum technological condition combination for extracting Tea polysaccharide is obtained. Result: The most significant factors for extracting Tea polysaccharide is lixiviating temperature, followed by the ethanol concentration、lixiviating time、pH value, optimum technological condition combination for extracting Tea polysaccharide is pH value for 4 、lixiviating temperature for 85 C、 lixiviating time of 1.5 h 、ethanol concentration of 75% , the average content of tea polysaccharide in the tea is 2.67%. Conclusion: With the above extracting technique , we can save the cost of the extraction process, can also improve the efficiency of extracting technique, ultimately we can provide new ways of comprehensive utilization of social and economic benefit for the crude tea.Key words Tea polysaccharide; extraction; orthogonal test; Optimum technological condition; Average content1 前言茶叶属于双子叶植物，中国人素有饮茶、品茶的传统习惯，在饮用之余，近些年来不少学者对茶叶中的成分进行研究，发现茶叶中存在多糖成分。我国对多糖的研究始于20世纪70年代，且发展很快。由于多糖中多种多样的生物活性功能以及在功能食品和临床上广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物化学、生物化学、生命科学的研究热点。茶多糖是茶叶中极具开发价值的一种生理活性物质，现代药理学研究表明茶多糖具有降血糖1、降血脂2-3、降血压、减慢心率、增加冠脉流量4、抗氧化5-6、抗凝血7等作用，近年来发现茶多糖还具有治疗糖尿病的功效8-9。 茶多糖提取工艺的研究对于茶多糖的提取率高低都有重要意义。苏永昌10对乌龙茶多糖的提取工艺进行了研究，得到最佳的提取工艺条件：料液比11，浸提温度100C，浸提时间3h，沉淀剂量为3倍体积丙酮；周小玲11对茶多糖进行了定量、定性及生物活性研究，表明绿茶中的茶多糖（TPS）具有很大的潜力开发为一种降血糖、降胆固醇的功能食品成分，具有广阔的应用前景；曹鹏飞12等运用正交试验设计优选茶多糖的提取工艺，得到最佳提取条件为：料液比110，浸提时间为60min，浸提温度为100C，沉淀时所用的乙醇浓度为75%。本文采用先水提后醇沉的方法分离提取茶叶中粗多糖，重点探讨了pH值单因素对茶多糖提取率的影响以及在正交试验条件下对茶多糖提取率的影响，再采用苯酚-硫酸法对茶多糖进行含量测定13-14，通过正交试验设计15，得到茶多糖提取的最佳工艺条件，为合理开发利用茶叶资源提供了理论依据。2 实验部分2.1 材料与仪器 2.1.1 材料与试剂无水乙醇、葡萄糖、5%苯酚、浓硫酸、蒸馏水等试验中所用化学试剂均为分析纯；配制45%、55%、65%、75%、85%、95%浓度的乙醇溶液；配制pH值为2、4的盐酸溶液；配制pH值为10、12的氢氧化钠溶液；通山眉茶（咸宁市茶叶市场提供） 2.1.2 仪器研钵、烧杯、玻棒、温度计、布氏漏斗、抽滤瓶、量筒（100ml）、胶头滴管、带刻度的试管、离心胶管、量杯（100ml）、容量瓶（10ml、50ml、100ml、250ml）、吸液管（1ml、5ml、10ml） 电子天平：FA1004型，上海良平仪器仪表有限公司尼龙分样筛：60目，上海锦联丝网经营部真空干燥箱：DZF - 6020型，上海精宏实验设备有限公司 调温电热套：KDM型，山东省鄄城永兴仪器厂旋转蒸发仪：RE - 5299，巩义市英峪予华仪器厂 循环水式真空泵：SHZ - D（III），巩义市予华仪器有限责任公司低速自动平衡离心机：LDZ4 - 0.8，北京医用离心机厂紫外可见分光光度计：UV - 1700型，SHIMADZU（日本岛津）2.2 茶多糖的提取方法 2.2.1 茶叶的预处理将干燥的茶叶放入研磨中碾磨、过筛，再碾磨再过筛，得到茶渣与粉末分别放入烧杯中备用。 2.2.2 茶多糖的提取 2.2.2.1工艺路线：取20 g茶叶 研磨、过筛（重复几次） 水浸提（控制浸提条件） 然后抽滤 取滤液 滤渣（再浸提一次） 合并滤液 于旋转蒸发仪 减压蒸发浓缩至原体积的20% 稍冷 加入一定浓度的乙醇 于离心机中离心分离（3000r/min、30min） 弃去上清液 得到沉淀物 洗涤、烘干 称重并计算提取率。 2.2.2.2操作步骤： 称取烘干后的茶叶，分别在设定条件下浸提，抽滤除去沉淀，重复2次，合并提取液，按照2.2.2.1工艺路线操作，主要操作步骤如下：减压浓缩：将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，水浴温度为60C。乙醇沉淀：在强烈搅拌的状态下向浓缩后的提取物中缓慢加入4倍体积一定浓度的乙醇，其间有絮状沉淀产生，静置10min。离心分离：将静置后的醇沉淀液中的絮状沉淀分离出来，转速3000 r/min，离心时间30min，完毕之后用95%乙醇洗涤沉淀3次。烘干：在温度为80C的鼓风干燥箱中烘干。2.3 茶多糖提取工艺条件的研究 2.3.1 单因素实验试验选择pH值、浸提温度、浸提时间以及乙醇的浓度作为单因素实验，进行茶多糖提取率影响因子的分析。选择浸提温度为55C、浸提时间1.5h、乙醇浓度75%条件下，分别在pH值为2、4、7、10、12下，进行茶多糖的提取；选择pH值为7、浸提时间1.5h、乙醇浓度75%条件下，分别在浸提温度为35C、45C、55C、65C、75C、85C、95C下，进行茶多糖的提取；选择pH值为7、浸提温度55C、乙醇浓度75%条件下，分别在浸提时间0.5h、1h、1.5h、3h、4h、5h下，进行茶多糖的提取；选择pH值为7、浸提温度55C、浸提时间1.5h条件下，分别在乙醇浓度为45%、55%、65%、75%、85%、95%下，进行茶多糖的提取。 2.3.2 正交实验设计根据单因素实验结果，选择pH值、浸提温度、浸提时间以及乙醇浓度为考察因素，采用正交设计实验，优化提取工艺的条件。根据四因素三水平可安排因素水平表：因素水平表水平因 素pH值（A）浸提温度（C）（B）浸提时间（h）（C）乙醇浓度（%）（D）14350.55527551.575310853952.4 茶多糖的含量测定 2.4.1 葡萄糖标准溶液的制备 精密称取105C干燥得到的恒定无水葡萄糖对照品10mg，置500ml容量瓶中，稀释到刻度，摇匀，即得。 2.4.2 标准曲线的制备精密量取已配制的葡萄糖标准对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m1分别置于10 ml试管中，各用蒸馏水补到2.0 ml，空白管吸取蒸馏水2.0 ml，与供试品管作以下同步处理。按苯酚-硫酸法测定的最佳条件16，在冰浴中加入1.0ml 浓度为5%的苯酚溶液，混匀，迅速滴加浓硫酸7.5 mL，摇匀，室温放置 15 min，然后置冷水中冷却 30 min显色，在 490 nm 波长处测定吸光度。以吸光度(A）为纵坐标，葡萄糖浓度(C)为横坐标作标准曲线及回归方程。 2.4.3 茶多糖的含量测定 （1）茶多糖含量的测定与计算精密吸取定容后的粗多糖溶液适量，加蒸馏水至2.0ml，用回归方程计算待测样品溶液中葡萄糖的浓度，按下式计算样品中茶多糖的含量17 ：茶叶中茶多糖的含量=茶多糖提取率粗提取物中茶多糖的含量 （2）重现性实验分别吸取定容后溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.5ml、0.4ml，制备不同浓度下的粗多糖溶液，补水至2.0ml后，按照上述2.4.2中的方法分别测定吸光度（A），计算含量，考察茶多糖含量测定的重现性。 （3）稳定性试验 精密吸取同一样品溶液1.0ml 按照上述2.4.2中的方法测定吸光度(A），每隔1h 测定一次，连续4h，考察茶多糖含量测定的稳定性。3 结果与分析3.1 单因素实验结果 3.1.1 pH值对茶多糖提取率的影响不同pH值条件下茶多糖的提取率见表1，pH值对茶多糖提取率的影响见图1表1 不同pH值条件下茶多糖的提取率pH值茶多糖的提取率（%）25.83%45.03%74.64%103.86%123.28% 图1 PH值对茶多糖提取率的影响 本文重点探讨了pH值对茶多糖提取率的影响，由图1可知，pH值对茶多糖提取率的影响较为显著，随pH值升高，茶多糖的提取率呈现下降的趋势，酸性条件下茶多糖的提取率更高，而碱性条件下茶多糖的提取率较低，因此引发了我们对茶多糖糖苷键水解条件的探讨。 3.1.2浸提温度对茶多糖提取率的影响不同浸提温度下茶多糖的提取率见表2，浸提温度对茶多糖提取率的影响见图2表2 不同浸提温度下的茶多糖提取率浸提温度（C）茶多糖的提取率（%）353.45453.74554.62654.46754.59855.04956.46 图2 浸提温度对茶多糖提取率的影响 由上图2可知，在35C - 55C水平，随浸提温度的提高，茶多糖提取率迅速上升，但在65C及75C条件下，茶多糖提取率增长率不大，而从75C - 95C，茶多糖提取率又迅速上升。据日本蓑和田博士的专利记载18 ，85C以上热水浸提可破坏茶多糖中降血糖的有效成分，故茶多糖提取温度不应超过85C。 3.1.3浸提时间对茶多糖提取率的影响不同浸提时间下茶多糖的提取率见表3，浸提时间对茶多糖提取率的影响见图3表3 浸提时间对茶多糖提取率的影响浸提时间（h）茶多糖的提取率（%）0.53.1213.621.54.6234.7044.7454.90 图3 浸提时间对茶多糖提取率的影响 由上图3可知，在0.5h -1.5h水平，随着时间的延长，茶多糖的提取率迅速上升，但从1.5h - 5h，茶多糖的提取率呈现平台趋势，上升很缓慢。由此可见，茶多糖的浸提时间宜使用1.5h。 3.1.4乙醇浓度对茶多糖提取率的影响不同乙醇浓度下的茶多糖提取率见表4，乙醇浓度对茶多糖提取率的影响见图4表4 不同乙醇浓度下的茶多糖提取率乙醇浓度（%）茶多糖的提取率（%）452.35552.89653.21754.82854.98955.15图4 乙醇浓度对茶多糖提取率的影响 由图4可知，在乙醇浓度为45% - 75%水平，随乙醇浓度的增加，茶多糖的提取率迅速上升，但从75% - 95%，茶多糖的提取率呈现平台趋势，基本没有多大变化。由此可见，提取茶多糖的乙醇浓度宜使用75%。3.2 正交实验结果与分析 3.2.1正交实验数据记录表5 正交试验表设计水平因 素pH值（A）浸提温度（C）（B）浸提时间（h）（C）乙醇浓度（%）（D）14350.55527551.57531085395表6 正交实验组数据实验组粗茶质量（g）茶多糖质量（g）茶多糖的提取率（%）120.601.266.12220.431.236.02320.490.834.05420.770.844.04520.240.783.85620.190.994.90720.791.376.59820.531.306.33920.641.276.15表7 正交实验组提取过程状态记录实验组提取中溶液的颜色过滤情况蒸发浓缩情况1淡红棕色易过滤易浓缩2棕绿色易过滤不易浓缩3棕黑色难过滤难浓缩4淡红棕色易过滤易浓缩5棕绿色易过滤不易浓缩6墨绿色难过滤难浓缩7淡红棕色易过滤易浓缩8棕绿色易过滤不易浓缩9深棕绿色难过滤难浓缩 由表7可知，茶多糖提取过程中，在偏酸性条件下，易过滤和浓缩，提取比较容易；对于碱性条件下，难过滤和浓缩，提取比较困难；而中性条件下，提取难易程度介于两者之间。故得出结论，酸性条件下，茶多糖比较容易提取分离。 3.2.2正交试验数据分析表8 L 9( 34) 正交实验设计及极差分析实验号因 素茶多糖的提取率（%）pH值（A）浸提温度（C）（B）浸提时间（h）（C）乙醇浓度（%）（D）111116.12221226.02331334.05412234.04522313.85632124.90713326.59823136.33933216.15K116.7516.1917.3516.12K216.2012.7916.2117.51K315.1019.0714.4914.42 k15.585.405.785.37k25.44.265.405.84k35.036.364.834.81极差R0.552.100.951.03主次顺序BDCA优水平A1B3C1D2优组合A1B3C1D2 由表8分析可知，影响茶多糖提取的最显著因素为B，即浸提温度，其次为乙醇浓度、浸提时间、pH值，在综合影响因素中pH值则为最不显著因素；在单因素的各水平上分析得到pH值的优水平为pH值为4时，浸提温度的优水平为温度85C时，浸提时间的优水平为时间0.5h时，乙醇浓度的优水平为浓度75%时，即最佳提取条件组合为A1B3C1D2 ，但茶多糖提取工艺的最佳条件组合得综合正交试验与单因素实验以及实际工艺情况考虑。3.3 茶多糖含量的测定 3.3.1葡萄糖标准曲线的绘制 表9 葡萄糖溶液的浓度与吸光度的关系葡萄糖溶液的浓度（ug/ml）吸光度（A）20.13940.27360.39680.529100.637 图5 葡萄糖溶液的标准曲线由图5可知，葡萄糖标准曲线线性回归方程为：A =0.0626C + 0.0192， R2= 0.9988。其中A 为吸光度； C 为葡萄糖溶液浓度(ug/ ml) 。该标准品在2.0 - 10.0g /ml范围内，标准曲线线性良好，从而由该回归方程式可以准确的计算茶多糖的含量(以葡萄糖计)19 。 3.3.2茶多糖的含量测定经上述茶多糖的提取分离，随机取茶多糖提取率为6.02%组的粗多糖，进行茶多糖含量测定实验，精密称取适量的粗多糖20mg定容至500ml。 3.3.2.1重现性实验分别吸取定容后溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.5ml、0.4ml，制备不同浓度下的粗多糖溶液，补水至2.0ml后，按照上述2.4.2中的测定条件，分别测定吸光度（A），并计算茶多糖的含量，考察茶多糖含量测定的重现性。表10 重现性实验结果序号12345粗多糖的浓度（mg/ml）0.0200.0160.0120.0100.008吸光度（A）0.5960.4640.3390.3010.240粗多糖中茶多糖的含量（%）46.144.442.645.044.1茶多糖的提取率（%）6.02%由表10可知，茶多糖含量测定的重现性分析，得知粗多糖中茶多糖的平均含量为44.4%，RSD=2.87% ( n= 5) ，则茶叶中茶多糖的含量为44.4%6.02%=2.67%，其含量测定的重现性比较好。 3.3.2.2稳定性实验吸取定容后的上述粗多糖溶液1.0ml，补蒸馏水至2.0ml，按照上述2.4.2中测定条件测定吸光度，并进行茶多糖的含量测定的稳定性分析，测定结果如下：表11 稳定性实验结果序号12345测定时间间隔（h）01234吸光度（A）0.5960.5900.5890.5860.585 由表11可知，对茶多糖含量测定进行稳定性分析，说明茶多糖的含量测定在4h内基本稳定。4 问题与讨论4.1 pH值影响因子的讨论单因素试验中，pH值对茶多糖的影响较为显著，从中我们得到，酸性条件时，茶多糖的提取率升高；碱性条件时，茶多糖的提取率反而下降。而pH值对茶多糖提取率的影响是本文重点讨论的因子，所以本文就pH值对茶多糖糖苷键水解的影响进行了相关推论：酸性条件对茶多糖糖苷键的水解不但不促进反而抑制其水解，从而促使茶多糖的提取率升高；碱性条件对茶多糖糖苷键的水解起到了促进作用，促进了茶多糖的水解，从而促使茶多糖的提取率下降。4.2浸提温度影响因子的讨论单因素试验中，浸提温度为85C时，茶多糖的提取率达5.04%。当浸提温度较低时，溶质的渗透能力和溶解能力较低，不利于多糖浸出，从而导致多糖的提取率较低。茶多糖的热稳定性较差，当浸提温度过高时，其中部分成分使大分子多糖的糖苷键断裂造成多糖的部分损失。王秀萍等20的单因素试验表明，70 - 80C的浸提温度有利于各茶样中茶多糖的提取及其活性的发挥，温度过高茶多糖的提取率反而下降。孙秋香等21的单因素试验也表明茶多糖的产量在60 - 70%时较高，而并非温度越高越好。据日本蓑和田博士的专利记载 ，85C以上热水浸提可破坏茶多糖中降血糖的有效成分，故茶多糖提取温度不应超过85C。4.3浸提时间影响因子的讨论茶多糖的浸出量一般与浸提时间成正比，但扩散达平衡后，时间即不起作用。达平衡的时间与溶剂体积、浸提温度有关。浸提时间过短，多糖不能被充分提取；浸提时间过长则可能使多糖在长时间的高温作用下发生裂解、氧化而使提取率下降。李碧婵等22的研究表明，在开始一段时间，茶多糖的得率随浸提时间的增加而增加，60 min以后，随浸提时间的增加，茶多糖产率下降。黄杰等23的单因素试验中，茶多糖的提取率随浸提时间的延长而增加，并没有出现产率下降的现象，这可能与其选择的浸提温度较低有关。4.4乙醇浓度影响因子的讨论乙醇沉淀多糖的主要原理是通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖，几乎适用于所有水溶性多糖。虽然不同多糖可在不同浓度乙醇的条件下分步沉淀，但从机理可知，乙醇浓度越高，多糖的沉淀率就会越高。由单因素实验可知，在乙醇浓度为45% -75%水平，随浓度的增加，茶多糖的提取率迅速上升，但从75% - 95%，茶多糖的提取率呈现平台趋势，基本没有多大变化，所以提取茶多糖的乙醇浓度宜采用75% 。5 结论 通过以上分析，我们得到的主要结论为：综合单因素实验和正交设计实验，可知pH值为4时，茶多糖的提取率较高；由实验数据与分析得知，浸提温度为85C时，茶多糖的提取率最佳；对浸提时间进行单因素分析，1.5h时提取率高，但正交试验分析0.5h提取率高，综合分析浸提时间对茶多糖提取的作用机理，我们认为浸提时间宜采用1.5h；乙醇浓度单因素实验和正交试验分析均显示乙醇浓度75%时，提取率比较高。所以综上所述，茶多糖提取工艺的最佳条件组合A1B3C2D2，即最佳工艺条件为pH值为4、浸提温度为85C、浸提时间为1.5h、乙醇浓度为75%。在对茶多糖的含量测定中，通过重现性实验，我们得到茶叶中茶多糖的平均含量为2.67%，稳定性实验测定表明，茶多糖含量测定的有较好的稳定性。参考文献1 王元凤,金征宇.茶叶中多糖的分离及降血糖活性的研究J.中草药,2005,36(10):1453-1457. 2 王丁刚,王淑如.茶叶多糖的分离、纯化、分析及降血脂作用J.中国药科大学学报,1991,22 (4):225-228.3 侯仰锋,汪东风,周小玲等.茶多糖对高脂血症大鼠血脂及肝脏中微量元素的调节作用J.营养学报,2008,30(3):269-272. 4 王丁刚,王淑如.茶叶多糖心血管系统的部分药理作用J.茶叶.1991年02期.5 聂少平,谢明勇,罗珍.茶叶多糖的抗氧化活性研究J.天然产物研究与开发,2005,17(5):549-552. 6 全吉淑,尹学哲,金泽武道等.茶多糖抗氧化作用的研究J.中药材,2007,30(9):1116-1118.7 梁进.茶叶多糖的化学修饰及体外抗凝血作用研究D.安徽农业大学,2008. 8 范斌.茶多糖降血糖作用的研究.糖尿病新世界J,2005年第03期.9 汪东风,王林戈,张莉等.绿茶对糖尿病的防治作用J.茶叶科学,2010,30(4):243-250. 10 苏永昌.乌龙茶多糖的提取工艺、生物活性及高多糖优异种质资源的研究D.福建农林大学,2006.11 周小玲.茶多糖的定量、定性及生物活性研究D.中国海洋大学,2007.12 曹鹏飞.茶多糖提取工艺条件的正交试验研究J.安徽农业科学,2007,35(14):4287-4287,4322. 13 M.Dubois, K.A.G., J.K.Hamilton, P.A.Robbers, et al. A colorimetrlc method for the determination of sugars. Nature, 1951, 168: 167.14 M.Dubois, K.A.G, J.K.Hamilton, P.A.Robbers, et al. Colorimctric method for dctcrmination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 1956, 28: 350-356.15 HE Cong-fen ,LI Peng,ZHAO Hua,SONG Li-ya,ZHU Jun,DONG Yinmao. Extraction Optimization of Polysaccharides from Pitaya Stems.Agricultural Science & Technology,2011,12(7);00017-00019,00049.16 罗毅,潘细贵,刘刚,李运飞等.苯酚-硫酸法测定多糖含量显色方式的优选J.中国中医药信息杂志;2005年01期.17 任少红,佟建利,李志富等.苦丁茶多糖的含量测定J.泰山医学院学报,2006,27(5):421-422.18 于淑池,林静等.龙井茶多糖的提取工艺研究J.安徽农业科学,2011,39(8):4776-4778. 19 武晓英,侯冬岩,回瑞华等.黑茶中茶多糖含量的测定J.鞍山师范学院学报,2011,13(2):36-38. 20 王秀萍,朱海燕,陈常颂等.福建茶树良种的粗茶多糖提取试验研究J.江西农业学报,2009,21(7):139-142.21 孙伙香,吴坷等.茶叶多糖的提取方法探讨J.湖北第二师范学院学院报,2009,26(2):36-38.22 李碧婵,马森等.武夷岩茶中茶多糖的提取研究J.南平师专学报,2007,26(2):40-42.23 黄杰,孙桂菊,李恒等.茶多糖提取工艺研究J.食品研究与开发,2006,27(6):77-79.致 谢 衷心感谢药学院的各位领导和各位老师四年来对我的精心栽培！特别 感谢胡老师对本论文的指导！ 感谢各位同学在实习期间给予的帮助！ 外 文 文 献 翻 译 译文题目： 苯酚-硫酸法测定传统 中药温郁金多糖的含量 苯酚-硫酸法测定传统中药温郁金多糖的含量摘要 温郁金在中国被广泛用作中药材。本文将使用苯酚-硫酸法测定温郁金多糖的含量。其中涉及三个因素，5%苯酚用量，硫酸用量，和水浴温度，我们采取L9(3)3 的正交试验设计，得到了最佳的比色方案为：将3.0ml的多糖溶液，5%苯酚溶液1.0ml和硫酸溶液7.0ml混合，于玻璃容器中以恒定的速率搅拌，然后保持水浴温度40C 。冷却到室温20min后，用UV-2501 PC 吸收光谱，测定在485nm波长处多糖的吸光度值，分别得到温郁金中多糖的含量为3.21%，3.23%，3.20%，3.18%，3.22%和2.38%。结果表明这个方法是准确，有效，和实用的，也可以用于其它细菌多糖的含量测定。关键词 含量测定； 苯酚-硫酸法； 正交实验设计； 多糖； 温郁金1前言 在中国温郁金是一个传统的药用植物，它的根在中国药典中明确指定为草药，即温郁金根，具有广泛的药用价值1-2。温郁金的首次使用记录是在公元627 - 649年的Yao Xing Lun中，具有排除血液淤积和减轻疼痛的功效3。现在它被用作治疗肝炎、月经不调和癫痫等，在很多中国家庭里，它的草药被用作温补食物。 近些年来，植物多糖已经被看作生物分子修饰中重要的一类。文献显示4-5酚类色素、香精油和多糖等都是温郁金中的主要成分。温郁金中的多糖具有抗肿瘤、抗氧化活性。本文采用超声波法提取温郁金多糖。多糖的含量测定采用苯酚硫酸法，用葡萄糖溶液制作标准曲线6。在一些测定多糖含量的比色法中，苯酚-硫酸法7-8是最容易和也最准确的方法。苯酚硫酸法的广泛运用在于他的灵敏性和简易性。其它方法如：蒽酮-硫酸法9，地衣酚法10、或间苯二酚法11灵敏性方面均可行，但是这几种方法操作不太方便。因为潜在的几种参数影响比色，故最优化的测定条件是比色最关键的一步。其中涉及的三个因素，5%苯酚用量，硫酸用量和水浴温度，采用了L9(3)3 的正交试验设计方案，得到了最佳的比色方案为：将3.0ml的多糖溶液，5%苯酚溶液1.0ml和硫酸溶液7.0ml混合，于玻璃容器中以恒定的速率搅拌，然后保持水浴温度40C 。冷却到室温20min后，用UV - 2501 PC 吸收光谱，于485nm波长处测定多糖的吸光度值。 2实验2.1器材和试剂KQ205B超声波清洗机（昆山超声波器械有限公司，中国）UV-2501 PC 吸收光谱仪（日本岛津公司，日本）所有化学试剂都为分析纯，来自天津化学试剂公司（天津，中国）所用样品和溶液都使用滤过和去离子的水2.2材料 温郁金的根来自中国不同地区（表1），通过浙江林业大学天然产物研究中心的凭证标本的比对，为LOU Lu-huan教授所确证。 样品已经风干，在高速旋转粉碎机中粉碎，粉末部分筛选通过60筛孔。之后粉末样品储存在称量瓶直到分析。2.3温郁金多糖的制备精密称取样品粉末2.000g，加入80%的乙醇于索氏提取器中预处理，除去有色物质，非活性酶，非天然的自由蛋白12。将残渣置入烧瓶中，加入30.0ml蒸馏水。然后将其放入KQ205B超声波清洗机中于60C提取30min。于提取液中加入95%的乙醇，放入4C的冰箱中冷藏过夜，沉淀得到多糖。沉淀物通过离心分离与乙醚和丙酮组成的混合液提取分离得到。此操作重复两次，就得到了温郁金中的多糖。多糖的测定采用苯酚硫酸法，用葡萄糖制作标准曲线6。2.4比色法的正交试验设计 因为不同潜在的参数影响比色，最优化的实验条件是比色的关键步骤。事实上，苯酚用量，硫酸用量和水浴温度被认为是重要的影响因素。比色方案可以通过逐步的实施或者采用实验设计以达到最优化。在现今的研究中，所有的选择因素都通过L9(3)3正交试验设计方案得到检验。不同的参数和用量如下表层现：（表2）2.5 统计学分析所获得的数据用ANOVA方法进行统计学分析（SPSS版本13.0）3结果与讨论3.1最大吸收波长的测定 最大吸收波长的测定采用略作修改的（Habibi，Mahrouz，Vignon，2005）13方法。将3.0ml的标准葡萄糖稀释溶液，5%苯酚溶液1.0ml和硫酸溶液7.0ml于玻璃容器中混合，然后以恒定速率进行搅拌，保持水浴温度40C. 在冷却至室温20min以后，于300 - 600nm波长范围内进行吸光度值测定。同时用3.0ml的蒸馏水进行空白对照试验。从吸光度值和吸收波长范围，我们可以观察到最大吸收波长为485nm。因此，我们选择485nm吸收波长作为最佳测定波长进行测定。3.2制作葡萄糖标准曲线 分别制备20、40、60、80、100g/ml葡萄糖溶液，精密吸取3.0ml标准溶液，置于玻璃容器中，同时加入5%苯酚溶液1.0ml和硫酸溶液7.0ml进行混合，保持水浴温度40C，并以恒定速率进行搅拌。在冷却至室温20min以后，于485nm波长处进行吸光度值测定。3.0ml空白样品溶液按上述操作进行空白试验。葡萄糖标准溶液的绘制：回归方程：A=0.0072C+0.0255；R2=0.9988。结果表明葡萄糖浓度和吸光度在20 - 100g/ml范围内有较好的线性关系。3.3比色法的最优化方案 L9(3)3 的正交试验设计在实验中进行。在现今的研究中，设计参数之间的交互作用被忽略。然而，实验进行中随机引入的需要避免的个人的或主管的因素，有意识到或没有意识到。对于三因素三水平的实验，传统全因素实验设计考虑需要33，即27次实验。然而在L9(3)3正交实验设计中，只需要做9次实验。（表3） 表3中的实验结果表明标准溶液的最大吸收值为0.756. 然而，基于表3的结果，我们不能选择最好的提取条件，我们需要对正交试验进一步分析。因此表4中计算得到了极差分析的K，k和R值，表5中列出了方差分析数据。 表5 对具有重要意义的F值（方差之比）进行了分析，可以看出对于A和B，P0.05 具有统计学意义，而对于C，其P0.05 不具有统计学意义。这些数据结果已经被PC%比例的分析进一步确证了。PC%的计算参照下列方程14： SS是纯平方之和，给定SS-SSerror ，SS单个之和的平方，SSerror是error之和的平方，SStotal是total之和的平方。在统计学中，SStotal 的数值被指定与SStotal 的数值相等，然而SStotal 的获得不同于SStotal ，SS之和是所考虑的因素。结果表明A对于吸光度值变化的影响因素（66.4%）是最重要的因素，随之是B（28.4%）和C（1.7%）。很明显PC%的分析数据与上述讨论获得的有重要意义的分析相一致。3.4转换因子的测定 取20mg温郁金多糖溶解在100ml的烧瓶中，振摇，加蒸馏水至刻度处。精密量取3.0ml的溶液，然后按照3.1中的操作步骤进行实验。转换因子可以通过下面的方程进行计算（Li，Zhou 2007）：W1 表示取自温郁金多糖的质量；C表示多糖溶液中葡萄糖的比例；D表示葡萄糖溶液的稀释倍数。计算结果得到f值为3.168 3.5多糖成分的测定 精密称取温郁金多糖，取一定体积的蒸馏水，共同加入250ml的烧瓶中，以恒定的速率搅拌促使其溶解，再加蒸馏水至刻度处。精密称取3.0ml的多糖溶液，按照3.1所述操作对其进行吸光度的测定。同时参照试剂按上述进行空白试验。多糖含量（%）可通过下列方程15进行计算：C表示样品（多糖提取液）中葡萄糖的含量（g）；D表示样品的稀释倍数；f表示转换因子；W2 表示样品的质量.多糖的含量测定数据见表63.6有效性分析3.6.1精密度实验取同一标准溶液重复进行实验6次。结果见表7：3.6.2重现性实验采用同样的方法进行试验，分析6个不同的样品温郁金多糖。结果见表8：3.6.3样品稳定性实验 在3h内每30min间歇一次测定一份多糖样品的吸光度值。在这个过程中，溶液在4C温度中储存。结果见表9：结果表明在3h内样品溶液保持稳定。3.6.4 回收率试验一份多糖样品中添加6次标准溶液，然后计算回收率。结果见表10：精密度实验、重复性实验、样品稳定性实验和回收率实验等都表明了此方法是准确、有效和可行的。4结论 在本文中我们选择了来自4个主要种植地区的温郁金作为我们的研究对象。选择正交实验设计作为我们实验的方法。基于正交实验的数据，进行方差分析后，得到苯酚用量和硫酸用量对比色的灵敏性有重要意义。我们得到温郁金多糖的含量分别为3.21%，3.23%，3.20%，3.18%，3.22%和2.38%.在这些结果的基础上，可以得出这样的结论：苯酚硫酸法测定多糖的含量是准确的、有效的和可行的。基于其多糖含量测定的简易性，对于其它多糖的含量测定，苯酚-硫酸法可以应用于细菌起源的复杂多糖的含量测定。参考文献1 Pharmacopoeia ,C.(Ed).Pharmacopoeia of the People Republic of China.Beijing:Peoples Medical Publishing House.2005.2 XIAO P.G.(Ed).Record of Modern Chinese Meteria Medica.Beijing:Chemical Industry Press.2002.3 LANG w.J.(Ed).A Thousand Formulae Prepared Decoctions for Anti-Cancer Beijing:Chinese Medicinal Technology Press.1992.4 XIA WJ，X O XH，LlU FQ，et a1Determination on chemical constitutents of Curcuma LProduced in ChinaChina J=ChinMaterMed,1999，2 (7)：423-4245 XIAO X.H.,SUZ.W.QIAO C.z.et a1.Advances in the study on medicinal plants of curcuma.Chinese Traditional and Herbal Drugs,1997,28(2):l14.118.(in Chinese)6 Chaplin ,M.F.(Ed).Carbohydrate analysis ,a practical approach Oxford: Press.1986.7 M.Dubois ,K.A.G,J. K.Hamilton,P.A Robbers,eta1.A colorimetric method for the determination of sugars.Nature,l951,168:167.8 M.Dubois ,K.A G,J.K.Hamilton,P.A.Robbers ,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances.Analytical Chemistry, 1956,28:350-356.9 A.Laurentin and C.A.E. A microtiter modification of the anthrone-sulfuric acid colorimetric assay for glucosebased carbohydrates.Analytical Biochemistry,2003,315(11):143-145.10 M.Ir