课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

微生物的培养与应用 一、课题目标 研究培养基对微生物的选择作用， 进行微生物数量的测定。 二、课题重点与难点 重点： 对土样的选取和选择培养基的配制。 难点： 对分解尿素的细菌的计数。 三、研究思路 微生物的选择培养，是指利用培 养基的组成使适宜生长的特定微生物 得到较快繁殖的技术，也称为微生物 的“选择培养”。 （一）筛选菌株 在本课题提供的选择培养基的配方中 ，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原 则上只有能够利用尿素的微生物才能够生 长。但实际上，微生物的培养是一个非常 复杂的问题，有些微生物可以利用其他微 生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选 择培养基上生长的微生物不一定是所需要 的微生物，还需要进一步的验证。 （二）统计菌落数目 统计菌落数目的理论依据是： 当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中 的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功 地统计菌落数目的关键。为了保证结果准 确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在 平板上，培养后再选择菌落数在30300 的平板进行计数。 1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出 每克样品中的菌落数？ 答：统计某一稀释度下平板上的菌落数， 最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平 均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。 A同学的结果与其他同学不同，可能 的解释有两种。 一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误。 （三）设置对照 究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况 下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结 果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 实验方案有两种 一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进 行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无 误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失 误或培养基的配制有问题。 四、实验案例 实验的具体操作步骤如下: 1.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去 表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事 先准备好的信封中。 土壤中某样品细菌的分离与计数 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌 液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生 长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目， 因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来 判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次 实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一 个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。每个 稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨 培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉 膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试 管和1个灭菌的移液管。 2.制备培养基 将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理 盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL） ，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛 有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次 等比稀释至107稀释度，并按照由107103 稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂 布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板 ，不必更换移液管。 3.微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在30 温度下培养 。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生 。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的 数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中 图2-10的颜色反应。 为什么分离不同的微生物要采用不同的 稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中 能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相 同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单 位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上 层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万 ，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因 此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的 稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选 择培养的条件。 4.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数 在30300的平板进行计数。在同一 稀释度下，至少对3个平板进行重复计 数，然后求出平均值，并根据平板所 对应的稀释度计算出样品中细菌的数 目。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。 关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。 五、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 六、课题成果与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以 及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌 落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择 培养基的数目，说明选择培养基已筛选 出一些菌落。 伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以 用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因 为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈 深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落 显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑 制其他微生物的生长。 例如：鉴别大肠杆菌培养基 大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 如果学生选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步 分析产生差异的原因。 （二）样品的稀释操作是否成功 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够 进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 本课题知识小结: 七、例题解析 例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的 。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定 时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。 测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生 长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能 通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而 不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种 量。 答案：A 例2在微生物群体生长规律的测定中 ，种内斗争最显著最激烈的时期是 A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期 解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生 物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足 的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的 增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少， 每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就 越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡 期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的 生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存 斗争主要是与无机环境的斗争。 答案：C 例3（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染 的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久 不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。 青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。 在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为 菌种或研究材料，此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。 对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵 液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算 发酵罐中菌体的总重量。 异养需氧型 次级 对数 个体的形态 生理特性 称菌体的湿重（烘干后重量） 解析： 青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型， 而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖 所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产