DNA的半保留复制semiconservativ.ppt

Chapter 3 DNA replication 一、DNA的半保留复制（semiconservative） 1、半保留模型的提出： 1953 Watson PriA (some phage) 2. 单链结合蛋白（single strand binding protein, ssb） 作用：防止单链退火 （在原核细胞中表现出协同效应） 3. 引发酶（primase） Dna G (E. coli ) 引发体 Primosome 4. DNA连接酶（DNA ligase） 需要能量 NAD（E. coli ）/ ATP（真核） 5. DNA螺旋酶（DNA gyrase）- 拓扑异构酶 断裂双链 引入负超螺旋 （swivel function) 需要ATP 6. DNA聚合酶（DNA polymerase, Pol） Three DNA Polymerases （E. coli） （1）Pol I DNA聚合酶 3 5 核酸外切酶（校对） 5 3 核酸外切酶（损伤修复、去除引物） 缺口填充 （大缺口） DNA 损伤修复 缺刻平移 Nick translation（去除引物） （2）Pol II 活性很低，不是DNA复制必需的 （3）Pol III 3 5 核酸外切酶 （校对） 亚基 DNA聚合酶（必需） 亚基（dna E） 缺口填充（小于100bp） 讨论： 1、Pol I and III功能上有哪些相同点？ 2、 Pol I and Pol III功能上有哪些不同？ （4）Pol I and Pol III相同的功能特点： 1 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物催化合成DNA 2 需要模板(3 5)和引物的存在 3 不能从头合成新的DNA链（必须有3 -OH末端） 4 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端 5 催化DNA合成的方向是5 3 6 有 3 5 核酸外切酶活性（校对功能） （5）Pol I and Pol III不同的功能特点： 1 5 3核酸外切酶活性不同。 2 Pol I 可进行缺刻平移、去除引物。 3 二者聚合酶活性不同，Pol III是大肠杆菌 DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。 4 Pol I 主要功能是进行DNA 损伤修复。 Composition of E. coli DNA Polymerase III Holoenzyme SubunitFunctionSubassemblies DNA polymerase 3- to 5- exonucleaseCore Stimulates exonucleasePol III Dimerizes core Binds complex Binds ATP Binds to PolIII Binds to and complex Binds to SSB( DNA-dependent ATPase ) Binds to and Sliding clamp 六、DNA聚合酶III 1、亚基 （1）结构：环状的二聚体 （2）作用：“活动夹板” 允许全酶沿着DNA滑动 使全酶的持续性很高 2、DNA聚合酶III-形成不对称的二聚体 使前导链、滞后链的合成可同时进行 后滞链模板形成了 一个回环，使环中 RNA引物和冈崎片 段的合成方向与前 导链一致，以适应 双链在同一复制体 上进行复制 3、回环模型 “”型复制 环状DNA的复制方式，即从复制起点开始 ，双向同时进行，形成样中间物 环节： DNA复制的起始 DNA链的延伸 DNA复制的终止 第二节 细菌DNA复制 一、细菌DNA复制起始 （一）复制起始复合体 DnaA（起始点结合蛋白) DnaB（解旋酶） SSB DnaC（装载解旋酶和引发酶） HU（识别并刺激OriC 形成开链） Gyrase（促旋酶）-拓扑异构酶 （二）复制起始区的结构特点 1、富含AT 2、3个13bp的重复序列-解链的位点 3、4个9bp的重复序列- DnaA结合位点 （三）复制起始引发的过程： 1、DNA复制起点双链解开 ，形成复制叉 GATCTNTTNTTTTTTATNCANA DnaA+ATP DnaB DnaC OriC （富含AT ） 313bp重复序列 49bp重复序列 DnaA结合位点 HU +ATP ATP 过程： （1）约20个DnaA结合在49bp重复序列 （2）DnaA复制起始复合物使13bp重复序列变性， 形成开链 （3 ）DnaB与单链DNA结合（需要DnaC帮助）， 进一步解开DNA双链，形成复制叉 2、RNA引物的合成 leading strand: primase（引发酶） lagging strand: primosome 引发体（引发前体primase） 引发前体：n蛋白、n蛋白、n”蛋白、i蛋白、 dnaB蛋白和dnaC蛋白 3、DNA聚合酶将第一个dNTP加到引物的3-OH末端 SSB DnaG primase DnaB helicase Pol III （ /） 引发体（primosome） Pol I、ligase 复制体（replisome） in vivo 二、细菌DNA复制延伸 （二）DNA聚合反应的特征 1、DNA的聚合反应是以dNTP为底物，以3 5 DNA为模板，按碱基配对原则在3-OH上加dNTP （DNA聚合酶对碱基的选择功能） 2、需二价正离子如Mg， 3-OH作亲核进攻形成磷酸 二酯键 3、链沿5 3方向延长 4、碱基互补配对，若错配则切除掉 （一）DNA复制体(replisome) DNA聚合酶全酶分子、引发体和解旋酶构成的复合体 （三）防止拓扑学问题两种机制 1DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解 链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋 所中和 2DNA拓扑异构酶可以打开一条链，使正超螺旋 状态转变成松弛状态；DNA拓扑异构酶(旋转酶) 可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双 链DNA nick结合Pol I 引物移动 / DNA合成 封闭缺口 降解的引物 DNA ligase （四）缺刻平移( Nick translation)去除引物 5 5 3 3 parent progeny AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCA terD / terA terC / terB Replication fork 1 Replication fork 2 tus gene 产物 复制终止区： 200 kb （DnaB inhibitor) 复制叉相遇位点 三、细菌DNA复制的终止 Topoisomerase IV：使复制叉解体，释放子链DNA （三）分离（segregation） （一）终止位点 一侧复制叉的终止位点位于相遇点的另一侧 （二）终止机制 1、Tus蛋白的作用： 可与终止序列结合，阻止复制叉继续前移 2、两个复制叉在相遇点相遇 3、两个复制叉在复制快的复制叉的终止点相遇 第三节 真核生物DNA复制 一、概述 （一）复制与细胞周期 S期 早：常染色质， 中：异染色质， 晚：着丝粒和端粒 （二）复制频率 每个细胞周期复制一次 （三）复制与核小体 1、 复制叉形成时DNA从核小 体解离，组蛋白八聚体解聚 2、复制叉通过后新、旧组蛋白 与DNA重新组装成核小体 成熟前起始 （快速生长的原核细胞内 ） 二、真核生物DNA复制的起始 （一）复制起始点（多个） 酵母：自动复制序列 （ARS） 特点：11bp的保守序列（富含AT） （起始位点识别复合体 ORC） （二）复制子簇（cluster of replicons） 特点 1、由多个复制子组成，20-50个串联排列 2、同一复制子簇内的复制子基本同步起始 三、真核生物DNA复制的延伸 （一）相关酶和蛋白质 1、解旋酶（RP-A，replication protein A） 2、单链结合蛋白 3、连接酶 I（DNA ligase I） 4、PCNA（proliferating cell nuclear antigen） -增殖细胞核抗原 与Pol 向Pol 的转换有关 5、聚合酶 （二）真核生物DNA聚合酶 1、 DNA Pol （作用：复制的引发） 复合体（ Pol /引发酶） （1）引发酶活性 合成前导链和每个后随链每个片段的RNA引物 （2）53聚合酶活性 可继续延长DNA（a few hundred nt）但很快 被 Pol 代替 2、 DNA Pol （作用：前导链、滞后链延长，校对功能 ） （1） 53聚合酶活性 （2） 3 5 核酸外切酶活性 Probable Roles of Eukaryotic DNA Polymerase EnzymeProbable role DNA polymeraseoriginate DNA replication DNA polymeraseDNA replication: leading strand lagging strand DNA polymerase Unknown, structure similar to DNA polymeraseDNA repair DNA polymeraseReplication of mtDNA 四、真核生物DNA复制的终止 1、终止位点： 不存在使复制叉终止和解聚的终止位点(Termini) 2、终止机制： 复制终止通过复制叉的相遇而终止 一、线状DNA末端复制问题 53 5 3 5 3 53 5 5 5 第四节 线状DNA的末端复制 线状DNA末端复制问题 1、复制后产生粘性末端（sticky end）：滞后 链的5端引物切除后，因没有3-OH存在 DNA聚合酶无法将缺少的部分补齐 2、染色体不稳定 3、染色体末端隐缩：DNA每复制一次，DNA 就缩短一次 讨论：环状DNA是否存在末端复制问题？ 二、T7 噬菌体DNA的末端复制 5 3 5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 互补的3端配对 5 3 3 5 聚合酶I和连接酶 封闭缺口 限制性酶 交错切割 5 3 3 5 聚合酶I 3延伸,完成复制 真核生物如何解决末端复制的问题? 三、真核生物染色体 DNA末端复制 （一）端粒（Telomere） 1、概念：是真核生物染色体末端的一种特殊结构 2、组成：端粒DNA / 端粒蛋白 （1）端粒蛋白 ：非组蛋白 （2）端粒DNA ： a、含数百个短的正向重复序列，富含GC b、通式：Cn（A/T）m n1，m=1-4 人的端粒DNA序列：（ TTAGGG）n 3、作用 （1）稳定染色体结构 （2）防止染色体末端融合 （3）保护染色体结构基因 （4）避免遗传信息在复制过程中丢失 附：端粒长度-分子钟(molecularclock) 的作用 随着细胞不断分裂，端粒的长度越来越短，当 达到一个临界长度，细胞染色体即失去稳定性， 阻止细胞进一步分裂的信号便发出。细胞将发 生凋亡（apoptosis） （二）端粒酶 1、组成 （1）蛋白质：逆转录酶 （2）RNA：约150nt，部分序列与端粒DNA互补， 可作为合成端粒DNA的模板 （端粒酶是自身携带RNA模板的逆转录酶） 2、功能：负责端粒DNA的延长，维持端粒的长度 3、存在部位： 在干细胞、生殖细胞和肿瘤细胞， 才可以检测到具有活性的端粒酶 4、端粒酶和衰老、肿瘤有关 （三）端粒DNA的复制 1、已存在的端粒DNA的复制： 与其它部分DNA复制一起完成 2、端粒DNA的延长 主要由端粒酶完成 （1）G链（G-rich strand）的合成 （2）C链（C-rich strand）的合成 .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC AACCCCAAC 5 3 35 dGTP .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT .AACCCCAACCCC AACCCCAAC 5 3 35 dGTP .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC AACCCCAAC 5 3 3 5 3 RNA template （1）G链的合成 G链的合成 1 端粒酶与端粒DNA结合，端粒中的RNA与凸出的 G链3端的TTG配对 2 以端粒酶的RNA为模板，在G链3从头合成DNA 3 延伸6个核苷酸 合成一个重复单位后，端粒酶向新合成的DNA 3 端移动，端粒酶中的RNA再与3端的TTG配对。进 行多个循环，G链3端形成多个短的重复序列 （2）C链的合成 两个模型 a、G链末端回折，形成发夹结构；DNA聚合酶延伸 b、 Pol a /引发酶合成RNA引物; pol a 延伸; primase primase .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC CCCCAAC 5 3 .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC CAACCCCAAC 5 3 .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC CCAACCC CAACCCCAAC 5 3 .TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG .AACCCCAACCCC AACCCCAACCC 5 3 DNA polymerase 引物合成 延伸 引物切除 3 5 C链的合成 1 引发酶以G链3端为模板合成一段引物 2 DNA聚合酶以G链为模板，补齐C链缺口 3 去除引物，在G链3端留下一个1216个核苷 酸的overhang（突出端） （四）端粒的形成 1、端粒DNA在与端粒蛋白共同作用下自身回折，在染色体 的末端形成一个大的DNA套索结构，即T -环(telomere loop) 。 2、端粒G链3单链末端取代了端粒上游区域的相同序列，形 成D-环 3、端粒DNA与端粒蛋白（非组蛋白）结合 附：真核生物DNA复制的特点 1、复制速度慢：50nt秒，为原核生物的110 2、多个复制起始点，可同时进行复制（并非所有复制子 都同时复制） 3、一个细胞周期只复制一次；而原核生物可不停复制， 复制可以成熟前起始 4、引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约 100-200nt，原核长约1000-2000nt。 一、滚环形（rolling circle）复制 噬菌体（例 X174）/ 真核rDNA / 细菌F因子 第五节 其他 DNA复制方式 1、概念： 一种复制模式，复制 叉沿环形模板复制一定次 数，每个反应中新合成的 链将前一反应中合成的链 抛出，形成与环状模板链 互补的一系列线性序列。 3-OH 5-P 5 5 2、复制过程： 1、复制起始于某一条DNA链上 2、新生DNA链延伸，不断取代母链 3、复制一圈，产生单位长度的线性DNA链 4、若复制继续进行，5不断甩出，可产生 多单元线性DNA链 3、复制方向：单向复制 4、被取代链的命运： （1）按单位长度切割 则产生单体，单体 可继续转化为环形 双链形式； （2）按多聚体长度切 割则产生一系列由 基本复制单位串联 而成的各种形式(线 形、双链环状等) 二、D- 环型（displacement loop） 动物线粒体 / 植物叶绿体基因组DNA 1、特点： （1）双链复制不同步（2）起始点异位（H链、L链各一 ） H L 哺乳类 D-loop：500-600bp 线粒体：一个-多个D- 环 叶绿体：2