TAB检测方法汇总.doc

TAB检测方法一、 美国库格方法（K氏培养基）1、 设备及材料1.1 天平 1.2 水浴锅1.3 灭菌三角烧瓶 （500ml, 250ml） 1.4 酒精灯1.5 抽滤装置（过滤器和抽滤机） 1.6 0.45m滤膜（50mm）1.7 医用镊子 1.8 灭菌平皿（90mm）1.9 培养箱2、培养基的制备2.1 在1L烧瓶里放入如下配料蒸馏水或去离子水 900ml 酵母浸膏（OX） 2.5g 0.25% 蛋白胨（MERK） 5.0g 0.50% 葡萄糖（MERK） 1.0g 0.10%吐温80 1.0g 0.10% 琼脂粉（北京奥博星） 15g 1.5%在121、15磅压力下高压灭菌15min，放置于46水浴里。 取2.5g苹果酸于100ml的烧杯里，加蒸馏水或去离子水100ml混匀并通过0.22m滤膜过滤除菌。2.2苹果酸溶液到调制的K-培养基里并小心混合，调整培养基pH值为3.70.1，注入酸化的培养基到灭菌平板里，让其凝固备用。3、操作步骤3.1、检样处理3.1.1 称取10克浓缩苹果清汁于250ML三角烧瓶里，加蒸馏水或去离子水90ML。3.1.2在80水浴上摇动加热13min（当样品温度达到80时开始记时）3.1.3在冷水里迅速冷却样品。3.2过滤培养3.2.1样品通过0.45微米的滤膜真空过滤。3.2.2移去过滤器的顶部，用无菌镊子从过滤器上移取滤膜放置在K-培养基平板 上。3.2.3轻轻按压滤膜，使滤膜与培养基之间没有气泡，保证与培养基接触。3.2.4将平板正面朝上置于41的培养箱内培养5天。4、菌落计数：计算滤膜上的菌落数。5、结果报告：报告每10克样品所含的菌落数。二、美国雀巢方法（K氏培养基）1、仪器和试剂A 、仪器 1.1 80C水浴锅1.2 温度计1.3 10ml移液管1.4 培养皿, 60 x 15 mm, #1007, B-D, Falcon Plastics, Oxnard, CA1.5 43C 的培养箱1.6 带盖子的灭菌试管和试管架, 20 x 150 mm1.7 0.45um滤膜,灭菌的微孔过滤器, TYPE HA, #HAWG047S0, Millipore Corp., Bedford, MA 017301.8塑料袋1.9显微镜,微生物载玻片,盖玻片微孔过滤器，灭菌镊子B 化学药品1.1苹果酸1.2灭菌的50 ml 蒸馏水空白1.3为洗涤过滤器和真空设备的灭菌蒸馏水C、试剂 A）蛋白胨 5 g酵母粉 2.5 g葡萄糖 1.0 g 吐温80 1.0 g琼脂粉 15 g.把这些成分加入到990 ml的蒸馏水中，加热使其沸腾。高压灭菌121C 15分钟，使用之前冷却到45C，用25% 灭菌的苹果酸溶液调节pH 达到3.7B）25%的苹果酸,必须经过无菌过滤并且在使用之前加到K氏培养基中.2、检测步骤样品准备用一个15 ml的广口吸管,以无菌操作移取10 ml样品并且将其加到20 x 150 mm的无菌试管中.另外再取15 ml 样品加入到另一个试管中(温度控制用),给此试管中插入一个温度计.1. 将两个试管都放入到80C的水浴中.(水浴锅中的水面应高于试管中的样品).当温度控制用的试管中的温度计达到80C时,开始计时10分钟.2. 10分钟后,迅速将试管放入冰浴.3. 将10 ml经过热处理的样品加到50 ml的灭菌水中.4 用真空泵将此60 ml全部通过0.45 m的滤膜.用10-20 ml的灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器.确信这张膜被真空抽干.将这张滤膜放到K氏培养基上.为了防止气泡,小心的使滤膜滚贴到K氏培养基上,并且用无菌的镊子轻敲滤膜,使滤膜的边缘紧贴在培养基上.5. 用密封的容器(塑料袋)将此培养基在43C 培养 3-5天.6. 计数平板上所有的菌落并且报告每10 ml 中检出的耐酸耐热菌的结果.三、日本嘉吉方法（YSG培养基）1 仪器和试剂1.1 恒温水浴锅：7011.2 恒温培养箱：451。1.3 灭菌培养皿：直径为90mm。1.4 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。1.5 灭菌三角瓶：500ml。1.6 灭菌蒸馏水。1.7 YSG培养基的配制：A组：酵母粉（MERCK）： 2.0g葡萄糖： 1.0g可溶性淀粉(MERCK)： 2.0g蒸馏水： 500ml把A组用1-2N硫酸或盐酸调至PH为3.70.1；B组：琼脂（MERCK）： 15.0g蒸馏水： 500ml把A组和B组分别在121 15分钟条件下灭菌，冷却至5060，把两者混合。2 、 操作步骤2.1 取样品50ml于一个无菌瓶中，另取同样品同体积于一个相同的瓶中做温度控制用，在温度控制瓶中插入温度计。2.2 把两个瓶都放入到70的水浴中。(水浴锅中的水面应高于瓶中的样品)，当温度控制瓶中的温度计达到70时，开始计时20分钟。2.3 20分钟后，迅速将样品放入冰浴。2.4 将经过热处理的样品加灭菌水稀释，稀释倍数约10倍左右。用真空泵将此样品全部通过0.45 m的滤膜。用灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器。确信这张膜被真空抽干。将这张滤膜放到YSG培养基上。为了防止气泡，小心的使滤膜滚贴到YSG培养基上，并且用无菌的镊子轻敲滤膜，使滤膜的边缘紧贴在培养基上。2.5 将此培养基在45培养 3-5天。2.6 计数平板上所有的菌落3、 数据处理检出的耐酸耐热菌以cfu/50ml报告。四、嘉吉方法：耐酸耐热菌检测（PDA琼脂）1. Method of detection of ATSB(ATSB = Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria) Materials 材料- 250 ml bottle with heat resistant screwcap. 250毫升带有抗热螺丝钉的瓶子- 100 ml bottle with aluminium screwcap. 100毫升带有率螺丝钉的瓶子- Demiwater - PDA agar merck PDA培养基- Magnetic stirrer/heater磁力加热器- 2000 ml erlenmeyer2000毫升的erlenmeyer- Dosagepipet of 1 milliliter千分之一毫升的吸量管- Pipet 1 ml 1毫升的吸量管- 9.5% tartaric acid solution.9.5%的酒石酸溶液- Temperature adjustable water-bath可调节温度的水浴- Sterile sample spoon or sterile hypodermic syringe (10ml).消过毒的样品匙或者消过毒的注射器（10毫升）- Petri dish 14cm diameter14厘米直径的Petri盘- Incubator培养器medium ATSB.ATSB媒介- Fill 90ml demiwater in 250ml bottle with screwcap, sterilize in autoclave during 15 minutes at 121C. - 将90毫升的demiwater注入250毫升带有抗热螺丝钉的瓶子，放在高压锅中在121C条件下杀菌15分钟。- Weigh 117.0 g of PDA agar- 称量117克PDA培养基- Dissolve the agar into 2000 g of demi water while heating/steering.- 在加热搅拌过程中，将培养基溶解在2000克demi water中- Fill 100 gram of dissolved agar into 100 ml bottle with alucap and sterilize during 15 minutes at 121C.- 将100克溶解后的培养基注入100毫升带有率螺丝钉的瓶子，并在121C的条件下杀菌15分钟- Cool solution back to 60C and add 1.0 ml 9.5% tartaric solution - 将溶液冷却至60C并 加入1毫升9.5%的酒石酸溶液- Cool further to 47.5C prior usage. - 在使用前进一步冷却至47.5C Procedure- For single strength juice: pour 100 ml of sample in an empty sterile screw-cap bottle.- 单一浓度的果汁：将100毫升的样品注入杀过菌的带有螺丝的空瓶中。- For concentrate add 10 grams of sample into a sterile screw-cap bottle containing 90 ml of sterile distilled water.- 浓缩果汁：将10毫升样品加入含有90毫升灭菌蒸馏水的带有螺丝的瓶子中- Heat-shock the sample by placing the bottle in an 80C water-bath for 10 minutes. - 在80C的水浴中加热样品10分钟。- Start timing when the sample temperature reaches 80C, and be sure that the water level in the bath is above the level of sample in the bottle.- 在样品温度达到80C时开始计时，并且保证水的液面高于瓶中样品的液面。- Quickly cool the sample by placing into ice or cold water.- 将样品至于冰水或者冷水中快速冷却。- Pour 50 ml of the agar into the 100 ml sample.- 将50毫升的培养基注入100毫升的样品中。- Divide the 150 ml mix over 3 large petri dishes, and swirl to mix well- 将150毫升的混合物分在3个大的petr盘中，并充分搅匀。- Allow the plates to solidify- 允许盘子凝固- Incubate the plates for 5 days at 46C +/- 1 C- 在46+/-1C的温度下，培养5天- Count the total of colonies on all three plates and record as:- 将3个盘子中的菌落群体计数并记录如下：- A) For single strength juice: Divide the total number of colonies on all three plates by 10 to obtain the count of Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria in cfu/ 10 ml of juice. (Sensitivity = 0.01 cfu/ml).- ）单一浓度的果汁：用除三个盘子中的菌落总数作为10克果汁中含有的ATSB数量（灵敏度= 0.01cfu/ml）- B) For concentrated juice: Record the total number of colonies on all three plates as is to obtain the amount of Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria in cfu/10 gram of concentrate. - ）浓缩果汁：记录三个培养皿中的菌落总数作为10克浓缩果汁中含有的ATSB数量五、ACB检测方法 有代表性的样品，最少10克, 稀释样品： 用1:10的比例，用消过毒的水 (YSG/BAT broth) 在80oC热处理10分钟，然后冷却至45oC 过滤(稀释后可过滤的样品可选择) 在45oC浓缩(不可过滤的样品)2-5天 Direct spread plating 0,1 ml (optional)/(sub)culturing filters, enrichment broths on K agar, and on YSG or BAT agar, 在45oC培养2- 5天培养媒介：K agar成份：酵母提取物 2.5 g蛋白胨 5.0 g葡萄糖 1.0 gTween 80 1.0 g琼脂 15.0 g准备将以上成份混合并加一升去除矿物质的水。用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)。冷却至大约50oC并用25%苹果酸将PH值调节至3.7。* K-agar可以从 Biotrace International BioProducts通过商业方式获得；产品号BP-0234-500； 网址：/.培养介质：YSG agar成份： 酵母提取物 2.0 g 葡萄糖 1.0 g 可溶性淀粉 2.0 g 琼脂 15.0 g准备： 将以上成份混合并加一升去除矿物质的水。用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)。冷却至大约50oC并用1 N HCl将PH值调节至3.7。*YSG agar 可以在德国达姆施塔特的Merck KGaA通过商业方式获得； YSG Agar用于微生物学，目录编号1.07207.0500。培养介质：BAT agar成份：A) CaCl2 .2H2O 0.25gMgSO4 .7H2O 0.50g(NH4)2 SO4 0.20gKH2PO4 3.0g霉菌提取物 2.0g葡萄糖 5.0g微量矿物质溶液*1.0ml去矿物质水 500ml用1N H2SO4 或者1N NaOH 调节介质的PH值至4.0。用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)并冷却至50oC。培养介质：BAT agar成份：*微量矿物质溶液CaCl2.2H2 0.66g； ZnSO4.7H2O 0.18g； CuSO4.5H2O 0.16g；MnSO4.H2O 0.15g； CoCl2.5H2O 0.18g； H3BO3 0.10g；Na2MoO4.2H2O 0.30g； 去矿物质水1000ml用高压灭菌器杀菌并冷藏。B)琼脂 15 到 20 g蒸馏水 500ml用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)并冷却至50oC。将容积相等的A和B溶液无菌混合，检查pH (如有需要，将PH值调至4.0),并倾倒入盘子中。* BAT agar 可以在德国达姆施塔特的Merck KGaA通过商业方式获得： BAT Agar适用于微生物学，目录编号 1.07994.0500。22、IFU- 程序1，适用于浓缩果汁和其他原料 检测从K agar, YSG agar and BAT agar上发展的生物群体。 YSG and BAT介质支持所有目前所知的alicyclobacilli种类的生长, 与K agar相比，他们可以看到更为广泛的其他生物群体种类。 从每一个挑选过的群体中，取一部分放在 K agar 盘子，一个盘子含有中性PH值介质， (例如PCA, TSA)和两个YSG agar盘子， 在45+1oC培养3-5天。 但是第二个YSG盘子在65+1oC条件下2-3天。 23、IFU- 程序1适用于浓缩果汁和其他原料 观察生长情况：中性PH值介质中的应该没有生长，在这个盘子中，如果发现有生长现象， 那么记录alicyclobacilli为阴性。 检查K agar群体上出现的孢子。如果在K agar介质上没有生长现象，那么在 YSG agar上应该有生长。 在YSG agar上不应该出现孢子群。所以需要在其他介质上生长的孢子群，像BAT agar。 适宜用pH 6时不产生孢子的假定alicyclobacilli群体。那些在65oC不生长的是假定的可产生污染的alicyclobacilli。25、IFU- 程序1 适用于浓缩果汁和其他原料用过氧化物酶测试方法检测vanillic acid产生的愈疮木酚像 A. acidoterrestris, A. acidiphilus, A. herbarius 和其他一些种类，在这个实验中也许呈阳性，但是它不是在所有的果汁生产过程中都会产生愈疮木酚。像 A. acidocaldarius在这个实验中会呈阴性。 过氧化物酶的确认试验可以在日本的Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd通过商业方式获得。 (联系: inagakikyokutoseiyaku.co.jp).26、IFU-程序1 适用于浓缩果汁和其他原料记录结果： 如果有使用过滤技术，用x