《郑州大学基因工程》PPT课件.ppt

抗菌肽基因工程表 达技术研究进展 姓名：刘 允 攀 专业： 生物工程 抗菌肽简介 n 抗菌肽是有机生物体用来抵御外来病原 体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分 子蛋白质,是很多种生物先天性非特异性防 御系统的重要组分。 n自20世纪70年代瑞 典科学家Boman等 从蚕蛹中分离得到 第一个抗菌肽 天蚕素(cecropin)以 来。人们陆续又在 昆虫、两栖类、水 生动物、及包括人 在内的哺乳动物甚 至植物及细菌等广 泛的生物谱中发现 了1700余种抗菌肽 。 n多数抗菌肽具有广谱抗细菌、真菌、病毒 、原虫和抗肿瘤功能及独特的作用机理,尤 其对耐药菌株有明显的杀灭作用,且不破坏 生物体细胞、无免疫原性。众多研究结果 表明,抗菌肽极有可能成为抗菌、抗病毒及 抗肿瘤药物的新来源,具有广阔的应用前景 。 华桑抗菌肽活性收缩水100mL 杭州露滋兰生物科技有限公司 功效： 调整皮肤 的酸碱度 平衡油脂 杀菌消炎 收缩毛孔 防止皮肤 皱纹和暗 疮的产生 1 抗菌肽的分类及来源 根据 抗菌 肽的 结构 可将 抗菌 肽分 为五 类 单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由无 规则卷曲连接的两段-螺旋组成的肽 富含某些氨基酸残基，可分为富含某 些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽和 富含半胱氨酸的抗菌肽 含一个二硫键的抗菌肽 有两个或两个以上二硫键 具有折叠结构的抗菌肽 由其他已知功能较大的多肽衍生 而来的具有抗菌活力的肽。 抗菌肽的来源 一般而言,抗菌 肽可通过以下 3种途径获得 从生物体内直 接提取纯化 化学方法 人工合成 采用基因工 程技术进行 抗菌肽人工 表达 n但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生,含量较低, 从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和 成本的要求高,难以规模化生产,并且对于某些高 等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多 肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技 术的产生,人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗 菌肽的研究提供了很大方便。 n诸多研究结果表明,由于抗菌肽分子较小,化 学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致 的生物学活性,但化学合成的方法同样存在 成本较高的问题,限制了抗菌肽的推广应用 。现代基因工程技术的发展使借助基因工 程技术大规模制备抗菌肽成为可能。 2 抗菌肽的基因工程表达 进行抗菌肽研究的两种表达体系 原核表达体系 中大肠杆菌表 达体系最具代 表性 真核表达体系有小球藻 表达体系、杆状病毒介 导的昆虫表达系统、 酵母表达体系,其中酵 母表达体系用的最多, 是真核表达体系的代表 2.1 大肠杆菌表达体系 n 由于大肠杆菌系统对许多蛋白质有较强 的耐受能力,能较高水平地表达多种蛋白质 使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达 系统,所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术 的主要宿主细菌,在抗菌肽的表达研究中也 得到了充分的应用。 n Peng等将人-防御素2(hBD2)的基因插入到pET -32a(+)中构建融合表达载体,以E. coli BL21为工程 菌进行表达,纯化后的蛋白质具有抗菌活性,该研究 结果表明,应用基因工程技术可以大规模制备抗菌 肽。Rao等(2005)采用串联表达的方式在大肠杆菌 中表达hPAB-取得成功,在18个不同重复序列的 串联表达体系中,3个重复序列时蛋白质产量最高, 达到菌体总蛋白的27.8%,相当于(3.150.45) g/L湿 菌。 n 包涵体可完全溶于8 mol/L的尿素,三聚体 形式的hPAB-可用Ni-NTA亲和色谱分离, 再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等(2008) 成功构建了串联表达rAlloferon-1的原核表 达系统,并在E.coli BL21DE3中成功表达,其 表达产物具有与合成的Alloferon-1和 Alloferon-1-EK相似的体外抗肿瘤细胞活性 。 n韩宗玺等(2008)采用GST基因融合表达系统 在E. coliBL21中重组表达鸡的Gal-9抗菌肽 基因,获得了理想的表达效果,诱导蛋白表达 量占细胞总蛋白的40%,并且大部分以包涵 体的形式存在。纯化后,检测其抗菌活性与 提取抗菌肽相似,说明有些抗菌肽在进行融 合表达时,不影响抗菌肽的抗菌活性。 n 谢芳等(2009)为了验证重组抗菌肽 Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总 RNA,经RT-PCR扩增抗菌肽基因Ranalexin, 克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表 达载体,进行原核表达,表达产物经复性纯化 后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌 活性。 n综合所述,原核表达是目前掌握最为成熟的表达系 统,是目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研 究的主要方式;其优点在于能够在较短时间内获得 基因表达产物,而且所需成本相对较低;但与此同时 ,原核表达系统还存在许多缺点,如通常使用的表达 系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基 因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过 量表达可能导致非生理反应。 n另外,目的蛋白通常以包涵体形式表达,导致 产物纯化困难。而且原核表达系统翻译后 加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性 较低。为克服上述不足,许多学者将原核基 因调控系统引入真核基因调控领域。 2.2 酵母菌表达体系 n酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制 及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产 生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。 n近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是 一种甲醇营养型酵母,能利用甲醇作为唯一碳源;它 拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径,乙醇氧 化酶(AOX)是甲醇利用途径的第一个酶,甲醇是这 个酶的诱导剂,而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑制 剂。 nHong等(2007)运用毕赤酵母表达系统表达了人皮 肤抗菌肽LL-37,该基因装载于pGAPZ-E/LL-37载 体,转染毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达。结果目的蛋 白以分泌物的形式表达,产物纯化后经藤黄微球菌 测试具有抗菌活性;该研究结果表明,抗菌肽可以通 过酵母真核表达系统表达,而不必与其他蛋白融合 。 n刘静等(2008)用果蝇CecropinA原始氨基酸序列基础上,利 用毕赤酵母菌偏好的密码子,反推出其基因的序列,根据需 要对其中部分密码子进行调整,并在毕赤达酵母中成功表达 ,但表达量不高,有待进一步的研究。仇妍虹等(2009)将重组 家蝇抗菌肽Des-HF基因克隆入酵母表达载体pPICZ-A,构 建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下, 相对分子质量约5000 u的重组抗菌肽Des-HF获得表达。 n抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡 萄球菌有较好的抑菌活性。以小鼠为试验 模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的 体内抗菌活性,试验结果表明,240g重组Des -HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度 的金黄色葡萄球菌(ATCC26003)和Cowan 的攻击。 n蔡晶晶等(2009)将黑鲷抗菌肽hepcidin与毕赤酵母 (Pichia pasto-ris) pPIC9K质粒连接,构建了分泌表 达载体pPIC9K/AS-hepc2。电击法转化重组表达 载体,经G418筛选和选择性培养基及PCR鉴定,得 到的克隆子都为甲醇利用正常性(Mut+)。以甲醇 诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku 左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin 的前体肽和成熟肽的大小相符。 n表达试验结果证明,随时间的延长,表达产物 量增多,至120 h达到高峰,表达产物具有很强 的热稳定性。用抑菌圈法测定重组蛋白Pro- AS-hepc2的抗菌活性,结果发现能抑制革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。 n综合所述与原核表达系统相比其优点是: 一、根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异 性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源 性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; 二、能诱导基因高效表达,为其他系统所不及; 三、能严格调控基因表达,既可控制基因表达的“开 关”,还可人为地调控基因表达量。 n真核表达系统蛋白表达水平高,生产成本低,但它们 的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳 动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其 表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后 的加工不完全相同,因而产生的重组蛋白的生物学 活性和免疫原性有时会有差别。如何克服在基因 工程表达中的缺点,是在抗菌肽生产表达中的重要 问题,同时也是研究表达体系要克服的难点问题。 3 展望 n抗菌肽与传统抗生素相比其抗菌性具有很大优越 性,特别是抗菌肽不产生耐药性;但抗菌肽的来源一 直是进行药理研究和推广应用难以突破的瓶颈。 由于抗菌肽的分子小