复件微生物检测-第5章.ppt

第五章 病原菌的检验 主要的食物导致的疾病 疾病致病菌潜伏期和特征相关食品 沙门氏菌病鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium） 猪霍乱沙门菌（S.enteritidis） 8-48h;肠毒素和细胞毒素肉类，家禽，鱼，蛋， 乳制品 弓形菌腹泻布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）严重腹泻，反复抽筋肉制品,尤其是家禽 弯曲杆菌病空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni） 2-10d, 毒素热不稳定牛奶，猪肉，家禽，水 李斯特菌病单核细胞增生李斯特菌与脑膜炎和畸型有关肉制品，尤其是猪肉和牛 奶 大肠杆菌腹泻 和结肠炎 大肠杆菌24-72 h夹生的碎牛肉，生牛奶 痢疾宋内志贺氏菌（Shigella sonnei） 福氏志贺氏菌（S. flexneri） 24-72 h蛋类，布丁 耶尔森菌病小肠结肠 炎耶尔森菌 (Yersinia enterocolitica) 16-48 h,一些热稳定的毒 素 牛奶，肉制品 贺邻单 胞菌 病 类志贺邻单 胞菌 （Plesiononas shigelloides） 1-2 h生的软体动物和外国旅 行食品 副溶血弧菌胃 肠炎 副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)16-48 h海鲜，贝壳类 肠道杆菌 正常菌群 致病菌 埃希菌属（EC） 变形杆菌属 克雷伯菌属 肠杆菌属 沙雷菌属 枸橼酸菌属 肠外感染 肠外感染 食物中毒 医院感染 致病性大肠埃希菌属（EC ） EPEC、ETEC EIEC、EHEC EAggEC 肠内感染 食物中毒 志贺菌属 A群痢疾志贺菌 B群福氏志贺菌 C群鲍氏志贺菌 D群宋内志贺菌 急性菌痢 慢性菌痢 中毒性菌痢 沙门菌属 肠道沙门菌 邦戈沙门菌 伤寒沙门菌 甲型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 丙型副伤寒沙门菌 肠热症 鼠伤寒沙门菌 猪霍乱沙门菌 肠炎沙门菌 食物中毒 败血症 耶尔森菌属 小肠结肠炎耶尔森菌 鼠疫耶尔森菌 食物中毒 鼠疫 u大肠埃希菌是肠杆菌科细菌中，从各种温血动物的 肠道中检出率最高的菌种。 u最早是由埃希（ Escherich）1895年在粪便中发现 而命名，又称大肠杆菌（coli），在鱼类、两栖类 、昆虫的肠道中也存在。 u从新生儿开始就终生存在，与人体是共栖关系，人 体供给它生长条件，而这类菌的代谢产物能抑制肠 道内其它分解蛋白质的细菌的生长，减少蛋白质分 解产物对人体的危害，并能合成VB,VK,供人体吸收利 用。 第一节 大肠埃希菌(Escherichia coli) n是一种条件致病菌。当机体免疫力降低时，或 侵入肠外组织，可引起肠道外感染，如肾炎、 胆囊炎、胆结石、膀胱炎、肺炎、败血症等。 n有些菌株致病性强，能直接导致肠道感染。 n药品、食品中有无大肠埃希菌及数量多少，可 判断药品、食品是否被粪便污染及污染的程度 。如果检出该菌，表明被粪便污染，且有可能 污染伤寒、痢疾或其他肠道致病菌 1.形态与染色 l是两端钝圆的革兰氏阴性短小杆 菌，有时近球形 l（1.1-1.5）m (2.0-6.0)m l无芽孢，以周身边毛运动或不运 动，某些菌株具有荚膜。 一、大肠埃希菌 的生物学特性 2.培养特性 l最适温度37 ，可在15-46 生长. l最适pH7.4-7.6。 l需氧或兼性厌氧。 l在EMB平板上，典型菌落呈紫黑色，有金属光泽； l在药品中分离到的菌株也有菌落呈粉色，无金属光泽 ，中心紫色，扁平，低度突起，光滑湿润。 l致病菌的菌落无色，透明或半透明。但由于药物的影 响，有可能改变，应挑取多种菌落进行鉴定。 3.生化特性 n能迅速分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露 醇等多种糖类，产酸产气。产生的丙酮酸 可分解为乳酸、乙酸、甲酸。甲酸又被分 解为二氧化碳和氢气。 n不分解尿素 nIMViC 反应+- 4.抗原结构 n菌体抗原（O抗原）：是细胞壁成分。耐热、121 不破坏，有171种血清型。 n表面抗原（K抗原）：是存在于荚膜、被膜体表部 分的抗原。不能被O血清所凝集，具有O不凝集性。 n鞭毛抗原（H抗原）：由不耐热的蛋白质组成，60 被破坏。共有56个血清型。 n抗原式为：O111K58H12 5.抵抗力 n对热的抵抗力较强 n在自然界中可存活数周至 数月 n对磺胺类、四环类等抗生 素敏感 n对煌绿染料比沙门氏菌敏 感 n耐胆盐 n对漂白粉、酚、醛等敏感 6.致病力 n侵袭力:K抗原、菌毛 n内毒素：类脂A n肠毒素：肠产毒型大 肠杆菌类似于霍乱弧 菌。产生两类肠毒素 。均在质粒中编码。 毒素类类型 热热不稳稳定性肠肠毒素（heat- labile toxin, LT） 热稳热稳 定性肠肠毒素（heat- stable toxin, ST） 分子量7 30001500-5000 耐热热性65 30min破坏100 10-20min不破坏 免疫原性有无 B亚单亚单位受体肠粘膜GM1神经节苷酯肠粘膜GM1神经节苷酯 致病机理刺激小肠上皮细胞的腺苷环化 酶，使ATP转化成cAMP，促进 肠粘膜细胞分泌，肠液大量分 泌引起腹泻 刺激小肠上皮细胞的鸟苷 环化酶，使cGMP水平升高 ，促进肠粘膜细胞分泌亢 进，引起腹泻 兔毛细细血管通透性增加无改变 乳鼠灌胃试验试验不敏感敏感 编码编码 基因质粒质粒 致病性大肠埃希菌主要分为五类： 肠产毒型（enterotoxigenic E.coli ,ETEC） 肠致病型 (enteropathogenic E.coli ,EPEC) 肠侵袭型 (enteroivasive E.coli ,EIEC) 肠出血型 (enterohemorrhagic E.coli ,EHEC)：又称Vero毒素 大肠埃希菌（Verotoxigenic E.coli ,VTEC ），O157：H 肠粘附型(enteroadherent, E.coli ,EAEC)：肠聚集型 菌型血清型吸附和入侵特征毒素病征 肠产毒型 ETEC O6,O8,O15,O20,O27, O63,O78,O80,O85,O 115,O128,O139,O148, O153,O159,O167 始终吸附小肠上 皮细胞但不入侵 LT ST 类霍乱腹泻，但不严重 肠致病型 EPEC O18,O44,O55,O86,O 111,O112,O114,O119, O125,O126, O127,O128,O142 丛状吸附小肠上 皮细胞，入侵， 破坏细胞 不明显婴儿腹泻，呕吐 肠侵袭型 EIEC O124,O143,O152进攻结肠细胞， 向邻近细胞扩散 细胞-细胞间传播，类似于 痢疾 肠出血型 EHEC O6, O26, O46, O48, O91,O98,O111,O112, O146,O157,O165 吸附、 结合、 破坏、进攻结肠 类似于志贺氏菌的 细胞毒素 带血腹泻，出血性结肠炎 ，进而发生溶血性尿毒综 合征（HUS），并形成血 栓，血小板减少性紫癜 肠粘附型 EAEC 血清型很广， O62,O73,O134 丛状吸附小肠上 皮细胞，不进攻 细胞 一些菌株有类ST毒 素、溶血素、细胞 毒素 腹泻，一些菌株会引发溶 血性尿毒综合征 引起腹泻的大肠埃希菌种类及主要特征 大肠杆菌O157 n1982年在美国的一次汉堡包食物中毒事件中首次被发 现。 96年在日本流行。 n寄生在牛、羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，中 毒者往往都伴有剧烈的腹痛、高烧和血痢，病情严重 者会危及生命。 n美国威斯康星大学绘制出其完整基因组图谱。发现了 1387个特有的新基因。 n具有一些被称为“DNA岛”的特殊片断，像岛屿一样 分散在整个基因组中。其中一些“DNA岛”里包含有 与致病过程有关的基因，能够控制产生毒素，或帮助 O157更牢固地附着在肠胃中。 大肠杆菌O26 n英2年死83人, 可导致血液感染及尿道感染，年纪较 大或患有其他严重疾病的感染人士很可能出现其他 并发症。 n导致血液感染的大肠杆菌个案，在过去10年来已上 升1倍； n抗药性的个案从2001年的2%上升至2004年的6%。 二、大肠埃希菌检查法 供试品 供试液 胆盐乳 糖增菌 MacC EMB 纯培养 乳糖发酵IMViC 报告 v革兰氏阴性无芽孢杆菌 v乳糖产酸产气或产酸不 产气 vIMViC试验为+-或-+- v判为检出大肠埃希菌 IMViC n靛基质试验(indol test)： 取培养物接种于胨水培养基，培养24-48h，沿 管壁加入柯凡克试剂数滴，液面呈玫瑰红色为阳 性. 原理： 含有色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸， 形成吲哚。吲哚无色，加入对二甲氨基苯甲醛后 ，形成红紫色醌式化合物，即玫瑰吲哚。 n甲基红试验(methyl red test)：取培 养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养 基，培养48h，沿管壁加入甲基红 试剂5-6滴，液面呈鲜红色或橘红色 为阳性。 原理：细菌发酵葡萄糖，在磷酸盐葡 萄糖胨水培养基中，发酵产酸，使 甲基红试剂变色而呈阳性反应。有 的细菌可使pH下降至于4.5或更低 ；有的则使发酵产物脱羧而产生中 性乙酰甲基甲醇，使pH回升至5.4 以上。 乙酰甲基甲醇生成试验 n(Voges-Prokauer test)：取培养物接种于磷酸盐 葡萄糖胨水培养基，培养48h，沿管壁加入a萘 酚乙醇试剂1mL，混匀，再加40%氢氧化钾试 液0.4mL，摇匀，4h内出现红色为阳性。 原理：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，再脱羧生成 乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中氧化生成二乙酰 （丁二酮）。再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用 生成红色化合物。一般情况下，与甲基红反应 呈相反结果。 n柠檬酸盐利用试验(citrate test)： 取培养物接种于柠檬酸盐培养基 ，培养2-4天，斜面有菌苔生长 ，培养基由绿色变为蓝色时为阳 性。 原理：柠檬酸盐利用培养基是合成 培养基，不含蛋白胨和糖类，以 柠檬酸钠为惟一碳源，磷酸二氢 铵为唯一铵盐，细菌在柠檬酸盐 利用培养基生长，柠檬酸钠被分 解生成碳酸钠与水，使培养基pH 升高，溴麝香草酚蓝指示剂显蓝 色。 硫化氢试验 n将细菌穿刺接种于三糖铁琼脂或克氏双 糖铁琼斜面、或硫酸亚铁琼脂中，24- 48h，培养基底层出现黑色即为阳性反应 。 原理：细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸 钠、亚硫酸钠的有还原作用，生成硫化 氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产 生不溶性黑色硫化亚铁。 血清学试验 n假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌 的琼脂培养物，用各类大肠埃希氏菌的多价O血清 做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时， 再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与 某一单价O血清呈强凝集反应，即为假定试验阳性 。 n证实试验:制备O抗原悬液,稀释至与MacFarland3 号比浊管相当的浓度。将O血清用生理盐水稀释至 1：40。在试管内等量混合，做试管凝集试验。混 匀后在50水浴箱内16h后观察结果。出现凝集则 可证实为O抗原。 氧化酶试验 待检菌新鲜培养物 挑菌落于滤纸 3618-24h 氧化型色素 阳性 细胞色素氧化酶 四甲基对苯二胺盐酸盐 a-萘酚乙醇溶液1-2滴 还原型色素 吲哚酚蓝 u避免同铁镍接触 u避免用含葡萄糖培养基 u菌落新鲜 u试剂新鲜 u有氧条件 三、MUG-Indole检查法 1.原理 97%的大肠埃希菌和部分志贺菌、沙门氏菌中含 有-葡萄糖醛酸苷酶（ -glucuronidase,GUD ）。 利用目标菌的限定酶作用的底物4-甲基伞形酮-D- 葡萄糖酸苷（4-Methylumbelliferyl- -D- Glucuronide, MUG）被-葡萄糖醛酸苷酶分解，在 366nm紫外灯下产生蓝白色荧光作为指示系统来鉴定 目标菌。 但漏检率为6%，因此采用与吲哚反应相结合，辅 以IMViC试验，在理论上检出率可达99%。24-48h可报 告结果。 2.检验程序 供试品供试液 BL增菌液 MacC EMB 疑似菌落 纯培养 乳糖发酵 IMViC 报 告 MUG蛋白胨 MUG+，I+ MUG-，I- MUG+，I- MUG-，I+ 革兰染色 报 告 3.注意事项 n配制MUG培养基时，务必校正pH值，pH不 得过7.4，否则MUG管自身发荧光。 n培养时间一般4h，24h，可延长48h。 n结果观察时要将阳性对照管、阴性对照 管和供试品的MUG管同时在366nm紫外灯 下观察，如阳性管荧光强烈时，可移去 ，以免影响另两管的观测。 四、肠毒素检验 n1.产毒培养：将试验菌株和对照菌株分别接于 0.6mL产毒素培养基内，37振荡培养过夜。 加入适量多粘菌素，37培养1h，4000r/min 离心15min，取上清，加入适量硫柳汞，4保 存待用。 n2.ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）检测 LT和ST 间接法 双抗体夹心法检测LT n结果判定：以酶标仪在492nm下测定吸 光度OD值，待测样本OD值大于阴性对 照3倍以上为阳性。或目测为橘黄色。 抗原竞争法检测ST 抗原竞争法测ST n结果判定： n以酶标仪在492nm下测定吸光度OD值。 阴性对照OD值-待测样本OD值 阴性对照OD值 目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。 100%50% 3 反向乳胶凝集法 （resersed passive latex agglutination, RPLA） 包