基因突变与DNA损伤修复(3).ppt

第十三章 基因突变 学习要点： 1.基因突变的相关概念 2.基因突变的分子基础 3.突变的修复机制 4.突变的检测 5.突变的遗传学效应 思考三大问题 1 突变是如何发生的(机理),突变的后果(修复 机理) 2 如何防止突变 3 如何利用突变 第一节 基因突变的相关概念 一、突变的概念 突变(mutation) :基因结构的改变，导致表型的改变的 变化 突变体(mutant)：具有突变表型的细胞或个体 正向突变(forward mutation)：偏离野生型性状的突变 反向突变(back mutation)：由偏离的性状回复为野生 型性状的突变 自发突变(spontaneous mutation)：在自然条件下产生 的突变 诱发突变(induced mutation）：机体在诱发环境下产生 的突变 生化突变(biochemical mutation）：使机体的代谢过程 发生改变或丧失的突变 无效突变(null mutaion)：完全丧失原有基因功能的突 变 渗漏突变(leaky mutation) ：部分丧失原有基因功能的 突变 致死突变(lethal mutation) ：影响生物体的生活力，导 致个体死亡的突变 条件致死突变(conditional lethal mutation)：在给定的 某种条件下可以存活，如果缺少这种条件就会致死 的突变 二、突变类型 1.突变发生的 细胞类型 体细胞突变(somatic mutation) Clone：无性繁殖。 生殖细胞突变(germinal mutation) 2.突变 的表型 (1)形态突变 morphological mutaion (2)生化突变 biochemical mutaion (3)失去功能突变 lossoffunction mutation (4)获得功能突变 gainoffunction mutation (5)致死突变 lethal mutaion (6)条件致死突变 conditional lethal mutaion 三、突变的性质 1.稀有性 2.可逆性 3.多向性（随机性） 第二节 基因突变的分子基础 一、自发突变(spontaneous mutation) 自发突变可能由复制错误、DNA损伤和转座作 用等引起。 1.DNA复制错误(errors of DNA replication) DNA碱基有互变异构体，造成DNA复制过程中 的DNA错配。 转换：Purine Pu;或者 Pyrimidine Py 颠换：Pu Py; 或者PyPu 移码突变：增加或减少几个碱基,导致蛋 白质翻译错位。 返回返回 缺失和重复：大片段碱基的缺失或重复， 如E.coli乳糖发酵调节基因lac中四碱基 重复序列。 野生型: 5GTCTGGCTGGCTGGC 3 突变型FS5: 5TGGCTGGCTGGCTGGC3 突变型FS2: 5GTCTGGCTGGC3 2.DNA损伤（lesions） 脱嘌呤 由于碱基和脱氧核糖间的糖苷键 受到破坏,从而引起一个鸟嘌呤或腺嘌呤从 DNA分子上脱落下来. 脱氨基 C脱氨基变成U;A脱氨基变成H,： A AT HT HC HC AT GC B GC GU AUAU GC AT 造成转换 氧化损伤（oxidative lesions）: O2 OH H2O2可对DNA造成损伤 二、诱发突变（induced mutaion ） 多种理化因素都可以诱导DNA的突变 1.诱变机制 碱基类似物 eg. 5BU 和5BrdU是胸 腺嘧啶(T)的结构类似物，酮式结构易与A配 对；烯醇式结构易与G配对。另有2氨基嘌呤 (2AP, A类似物)、5 氟尿嘧啶、5氯尿嘧啶等 。 特异性错配 eg.烷化剂: 甲基磺酸乙酯 (EMS)、亚硝基胍( NG)、芥子气等。通过 改变碱基结构使碱基错配。 如：GC; 当G烷基化后可与T配对，导 致碱基转换。 或者烷化剂使嘌呤脱落，造成转换、颠换 、断裂或其他突变 嵌合剂的致突作用 eg. .吖啶类染料: 吖啶橙、吖啶黄素、原黄 素等碱基对的类似物，易造成移码突变。 辐射诱导效应 (1)紫外线UV:形成嘧啶二聚体，如T二聚体， 同一条单链内，影响复制时与A的配对，使 复制中止；双链之间，影响双链变性，并影 响复制。 重复、缺失、移码突变 (2)电离辐射：如Xray、可引起碱基的降解 或脱落，A变成H; C变成T，出现转换。 物理物理化学生物化学大分子 损伤 黄曲霉的作用 使鸟嘌呤G脱落，SOS修复引入A, 造成突 变。 2.碱基替换的遗传效应 () 同义突变（samesense mutation）不改变氨基 酸的密码子变化，与密码子的兼并性有关. 如 GAU/GACAsp. () 错义突变（missense mutation） 碱基替换的 结果引起氨基酸序列的改变. () 无义突变（nonsense mutation）编码区的单 碱基突变导致终止密码子(UAG/UGA/UAA)的形成, 使 mRNA的翻译提前终止, 形成不完全的肽链. 如镰刀型贫血症：血红蛋白B链(146Aa)，6号氨 基酸的替换, 导致明显的表型症状。GluVal, 若Glu Asp则影响较小。 3.移码突变及其产生 在基因的外显子中插入或缺失1, 2或4个核苷酸,使阅 读信息发生错位,从而使翻译的蛋白质序列与原来完 全不同. eg. E.coli中乳糖发酵的调节基因(lac): 野生型: 5GTCTGGCTGGCTGGC3 移码突变: 5GTCTGGCTGGCTGGCTGGC3 移码突变 : 5GTCTGGCTGGC3 4.突变热点和增变基因 基因中 某些位点比其它位点突变率高， 称突变热点。 Eg. 分析T4Phage r 基因1500个突变体 ： r A (1800bp)有200个位点； r B (850bp)有108个位点 。 形成原因： 1. 5MeC的存在，5甲基胞嘧啶(MeC)脱氨基后 变成T, 使GC部位转变成AT部位； 2. 短的重复序列的存在，容易配对错位，造成 重复或缺失 3. 与诱变剂类型有关，不同诱变剂出现不同的 热点。 4. 增变基因(mutator gene)：该基因的突变会 使整个基因组的突变频率增高，eg. A. DNA多聚酶基因，突变后使多聚酶的 3 5校正功能降低或丧失，使基因组突 变频率增高； B. dam基因，突变后使碱基的错配修复 功能降低或丧失，使基因组突变频率增高 。 三、诱变与肿瘤 肿瘤的形成与否取决于机体中癌基因和抑 癌基因的平衡，抑癌基因突变会致癌。一些诱 变剂可以特异性的诱导抑癌基因突变，导致肿 瘤发生。eg. 黄曲霉素、UV(ultraviolet)等. 黄曲霉素可诱导P53基因G T颠换，导 致肝癌的发生； UV可诱导P53基因5 TC3发生C T颠 换，形成“T二聚体”，导致人类鳞状细胞皮肤 癌的发生。 四、定点诱变 定义：利用人工合成的寡核苷酸，在 离体的条件下，制造基因中任何部位的位 点特异性突变的技术。 反义遗传学（reverse genetics）: 合成连接(单链M13)复制转化 检测 第三节生物体对突变的修复机制 一 光复活(photoreactivation) 1. 概念：在可见光存在的条件下，在光复活酶 作用下将UV引起嘧啶二聚体分解为单体的过 程。 2. 条件：可见光(300600nm)、PR酶、嘧啶二 聚体 3. 作用过程：P317 光复活酶与T=T结合形成复合物; 复合物吸收可见光切断T=T之间的CC 共价键,使二聚体变成单体; 光复酶从DNA链解离. *光复活是原核生物中的一种主要修复形 式。 二 切除修复 1.概念:（核苷酸外切修复、暗修复）先在损伤 的任何一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段 寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补， 再由连接酶将其连接起来。酶作用不需要光的 激活，但黑暗不是必要条件。 2.特点：消除由UV引起的损伤，也能消除由电 离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除的 片段可由几十到上万bp，分别称短补丁修复 、长补丁修复。 3.过程： 内切酶的作用在DNA损伤的一端,切开形 成一个切口; 外切酶的作用将损伤部位切除; 聚合酶的作用将切口补齐,留下一个切口; 连接酶的作用将DNA连接形成完整的 DNA链。 返回返回 4.特异性切除修复 E.coli 中明显的损伤，可在UvrA、 UvrB、 UvrC 的作用下得以修复，但不明显的损伤需要特异性修 复。 (1)糖基化酶修复：如果碱基被共价修饰，糖基化酶 可作用于CN糖苷键，使碱基释放，产生无碱基(AP) 位点, 再由AP内切酶修复系统修复。 (2)AP内切酶修复系统修复：也由内切、外 切、聚合和连接四种酶活性来完成，以修 复AP位点。 *以上两种修复过程都没有涉及到DNA的 重组,属于无误差的修复。 三 重组修复 1.概念: 通过对DNA的复制和同源链的重组，来 完成对损伤部位的修复，又称复制后修复。 2.特点: 修复过程伴随DNA的复制和重组； 仅修复新合成的不完整的单链，原先的损 伤单链仍然保留； 部分重组蛋白的精确性差，修复的出错率 较高。 3.重组修复过程： (1)复制：以损伤单链为模板复制时，越过损伤部位 ，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双链 。 (2)重组：缺口单链与完整同源单链重组，缺口转移 到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链仍 然保留。 (3)再合成：转移后的缺口以新的互补链为模板聚合 补齐。 四 SOS修复 1. 概念：是在DNA分子受损伤的范围较大而且 复制受到抑制时出现的一种应急修复作用。 2.可能的机理:过程 当DNA损伤较大时(如产生很多的T=T)， 正常的DNA多聚酶复制到损伤位点时，其活性 受到抑制； 返回返回 短暂抑制后产生一种新的DNA多聚酶，催 化损伤部位DNA的复制，由于新的DNA多 聚酶的修复校正功能较低，新合成的碱基 错配频率较高，易引起突变。 3.特点： 修复系统需要在DNA分子受损伤的范 围较大而且复制受到抑制时才能够启动。 修复系统对错配碱基的修复校正功能 低下，从而增加突变的频率。 在紧急情况下，细胞通过一定水平的 变异来换取细胞的幸存，有利于细胞逃生 。 4.SOS系统的启动： 通过操纵子(结构基因、启动子、操纵基因、调节基 因)来实现： A. SOS基因：recA基因、UvrA、UvrB、UmuC等 ，也称din基因 (damage inducible gene)，为操纵子 的结构基因； B. lex基因：阻遏蛋白基因，正常情况下结 合在操纵基因上； C. recA基因：重组蛋白基因，应急状态下 启动蛋白质水解酶活性，水解阻遏蛋白， 使din基因高效表达，从而启动SOS修复系 统。 五 电离辐射损伤的修复 1电离辐射效应 2电离辐射的修复 氢键断裂： 1.电离辐射效应 共价键断裂： 交联作用： 2.电离辐射的修复： 1、超快修复(0, 2min) (E. coli) 无O2、单链 (DNA连接酶) 2、快修复(几分钟) 其余90断裂单链 (聚合酶) 3、慢修复(37 ,4060min) 剩余单链 (重组修复酶系统) 六 修复缺陷与人类疾病 1. 着色性干皮病 (XP, xeroderma pigmentosum) 位于1p的隐性基因控制，干性皮肤伴随神经系 统疾病，由切除二聚体能力缺损造成。 2. Cockayne Syndrome (CS) 侏儒、视网膜萎缩。由缺损紫外线引起的DNA 损伤修复系统引起。 3. 共济失调毛细血管扩张症 4. 早老症 第四节、基因突变的检测 一、大肠杆菌 突变体的检测 1.影印法StrR突变体 单菌落基本培养所有菌落生长挑选抗性菌落抗性培 养 StrR培养抗性菌落生长 (影印) StrR 菌落 2.青霉素法营养缺陷突变体 （验证）（验证） 二 真菌营养缺陷型的检出 菌丝过滤法麦孢菌营养缺陷型 三 果蝇突变的检出 1.性连锁基因隐性突变的检出(ClB法、 Muller 5) (1) ClB品系：C交换抑制因子；l隐性致 死突变；B棒眼 检出步骤：A. 将待测的果蝇与杂合（ ClB/+）果蝇杂交； B. 将F1 ClB 与F1 （野生 型）单对杂交，目的是检查某一特定X染色体 上的突变； 返回返回 Step Step Step Step 类似类似L L纯合纯合 B B C. 观察分析： 有X隐性致死突变，F2 无雄蝇(:ClB 和l死亡); 隐性非致死突变， F2预期 :=2:1， 突变性状只在F2雄蝇表现，F1ClB中不表现 ； 无X隐性突变，在F2 仅表现简单的 :=2:1。 (2) Muller-5法： A. Muller5品系:B(棒眼)Wa(杏眼)sc(小盾 片少刚毛)并具重复倒位。 B. 检出步骤 : . 将待测的果蝇与纯合Muller果蝇 杂交. . 将F1 自交, 目的是检查某一特定 X染色体上的突变. 返回返回 . 观察分析F2： 如果无X隐性致死突变预期F2 : =1:1 表型比为简单的1:1:1:1; 如果有X隐性致死突变预期F2 : =2:1 表型比1:1:1; 如果有隐性非致死突变 在F2 中可见突 变。 返回返回 2. 常染色体突变平衡致死系(Cy和 S) 将待测的果蝇与平衡致死系(Cy, S)果蝇 杂交，F