基因组测序与序列组装.ppt

第一讲 基因组测序与序列组装 任科教师: 余爱丽 生命科学院 分子生物 学与生物信息学系 主要内容: n什么是基因组 n什么是基因 nDNA测序的方法 nDNA序列的组装 n人类基因组计划 n水稻基因组计划 n后基因组学 1. 什么是基因组 基因组就是一个物种 中所有基因的整体组 成。 基因组有两层意义： 遗传物质和遗传信息 。 要揭开生命的奥 秘，就需要从整体水 平研究基因的存在、 基因的结构与功能、 基因之间的相互关系 。 Zea mays 8,000 Homo sapiens 3,000 Oryza sativa 400 Drosophila melanogaster 165 Arabidopsis thaliana 100 Saccharomyces cerevisiae 12 E.coli 4.6 Genome Size (Mb) 什么是C 值？ 通常是指一种生物通常是指一种生物单倍体基因组单倍体基因组DNADNA的的 总量总量. . 在真核生物中，在真核生物中，C C值一般随着生物的进化而值一般随着生物的进化而 增加，高等生物增加，高等生物C C值一般大于低等生物。值一般大于低等生物。 C值悖理： 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比 例增加 细菌 真菌 等 动物 阴影部分为一个门内C-值的范围 重复顺序 高度重复顺序： 长度：几个几千个bp 拷贝数：几百个上百万个 首尾相连，串联排列 集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等） 也称卫星DNA 中度重复顺序： 一般分散于整个基因组中； 长度和拷贝数差别很大 单一顺序： 基因主要位于单一顺序 动物中单一顺序约占50 植物中单一顺序约占20 DNA 的复性 遵循二级反应动力学，可表述为 ： dCt / dt = -KC02 反应达 t 时，单链DNA浓度 = Ct C0 = 单链 DNA起始浓度 K 复性速度常数 顺序复杂性 Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常数 Ct/C0 0 1 0 1 C0t(1/2) C0t(1/2) C0t(1/2)值与基因组复杂性成正比。 是遗传信息的物理和功能单位，包含产生 一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸 序列。 基因分类： 编码RNA的基因，如rRNA基因，snRNA 基因等； 编码蛋白质的基因 2. 什么是基因？ 基因的不连续性 Intron 和Exon: 大多数真核生物蛋 白质基因的编码顺 序(Exon)都被或长 或短的非编码顺序 (Intron)隔开 基因家族 一群具有一致的或相似顺序的基因,有的还担负 类似的生物学功能, 可以相互补偿, 比如:E2f transcription factor Mouse symbolHuman Ortholog E2f1E2F1 E2f2E2F2 E2f3E2F3 E2f4E2F4 E2f5E2F5 E2f6E2F6 假基因(Pseudogene) 来源于功能基因 但已失去活性 的DNA序列 产生假基因的原因有: 1. 由重复产生的假基因; 2. 加工的假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合 到基因组中; 3. 残缺的基因(Truncated gene) 重叠基因重叠基因: : 同一段同一段DNA DNA 能携带两种不同蛋白的信息能携带两种不同蛋白的信息. . 重迭基因有以下几种情况： *一个基因完全在另一个基因内部 *部分重叠 * 两个基因共用少数碱基对 *一个基因完全在另一个 基因内部 如：B和A， E和D 其读码结构互不相同 -ATG-/-AATGCC -/-ATAACG-/-TAA- A* B ATGCCN-NNATAA *部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数 碱基对 如： D和J -TAATG- D 终止密码子 J 起始密码子 3. DNA测序的方 法 n链终止法测序 n化学降解法测序 n自动化测序 n非常规DNA测序 3.1 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止反 应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而 来读取待测DNA分子的顺序。 技术路线与要求 制备单链模板 将单链 模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产 物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA A 高酶活性 B 无53外切酶活性 C 无35外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3碳原子连接 的是氢原子,不是羟基 3.2 化学降解法测序 n基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学集 团,再用化合物处理,使DNA分子在被修 饰的位置降解. 技术路线 将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素 标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的 降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 碱基特异修饰方法 GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键 C+T肼可打开嘧啶环 ,后者重新环化成五元环 后易除去 C1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶 化学法测序实例 哌啶 3.3 自动化测序 n基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同 的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标 记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于 每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 3.4 非常规测序 n 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时 间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. n 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3-末端时会释放1 个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化 学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核 苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录 核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶 迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. nDNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点 播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测 的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在 确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的 顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 利用基因芯片进行杂交测序的原理 4 序列的组装 4.1 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼 此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. ABC ABC ABC ABC 小片段测序 计算机拼装 ABC 小片段测序 计算机拼装 鸟枪法(Shotgun)测序的问题 CAATGCATTA GCAGCCAATGC GAP 错装 实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及 顺序组装 超声波打断纯化的基因组DNA 琼脂糖电泳收集1.62.0Kb的区段、纯化 构建到质粒载体中 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序 为11 631 485 bp 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, 各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙 载体或宿主菌载体或宿主菌 选用不当而被丢失选用不当而被丢失 的顺序的顺序 测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序 解决办法:通过相邻已知 顺序作为探针筛选已有 的基因组文库 解决办法:利用其它宿主菌与 载体重新构建文库 4.2 限制测序 n 限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺 序进行组装. 一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基 因组测序中也采用这一方法. 如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据 克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序, 再进行序列组装； 水稻基因组测序计划采取得策略与此相同 . 4.3 指导测序与序列组装 建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导 鸟枪法”或”指导测序”。 在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法， 其基本步骤如下: A 构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向 测序; B 构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测 序,读取2个端部顺序; C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点 ,进行序列组装，排成重叠克隆群. 先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用 分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别 测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策 略. ABC ABC 大片段contig 小片段测序拼装 两种策略的比较 鸟枪法策略 指导测序策略 不需背景信息 构建克隆群 (遗传、物理图谱) 时间短 需要几年的时间 需要大型计算机 得到的是草图(Draft) 得到精细图谱 4.5 其他测序路线 n重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关 的基因优先测序. 如:人类主要组织相容性复合区位于第6 号染色体,与人类免疫系统有关，因而 优先测序. nEST (Expressed sequence tag) 测序 EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探 针很容易从 cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆 中找到其基因组的基因序列. 优点: A mRNA 可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比 较容易构建; B 对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列; C EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域, 一次测序的结果足以鉴定所代表的基因; 5.人类基因组计划 人类基因组计划 （Human genome project）于1990年 启动，我国于1999 年加入该计划，承 担其中1%的任务， 即人类3号染色体短 臂上约30Mb的测序 任务。 5.1 人类基因组计划的目的 n阐明人类基因组30亿个碱 基对的序列，发现所有人 类基因，并搞清其在染色 体上的位置; n破译人类全部遗传信息， 使人类第一次在分子水平 上全面地认识自我; n解码生命、了解生命的起 源、了解生命体生长发育 的规律; n认识种属之间和个体之间 存在差异的起因、认识疾 病产生的机制以及长寿与 衰老等生命现象、为疾病 的诊治提供科学依据。 5.2 人类基因组草图的完成 2000年6月26日是人 类历史上值得纪念的 一天。人类基因组的 工作草图已经绘制完 毕并于这天向全世界 公布。最终完成图要 求测序所用的克隆能 忠实地代表常染色体 的基因组结构，序列 错误率低于万分之一 。 A. Celera Genomics 人类基因组的测序 策略 5.5.3 3 人类基因组测序策略人类基因组测序策略 采集采集5 5个自愿者的个自愿者的DNADNA样品样品 构建构建3 3种不同插入子大小的基种不同插入子大小的基 因组文库因组文库2Kb, 10Kb2Kb, 10Kb和和50Kb50Kb 完成约完成约27002700万次万次 插入子末端测序插入子末端测序, , 总长总长14800Mb14800Mb GeneBankGeneBank下下 载载104018104018个个 BACBAC末端顺序末端顺序 PFPPFP发表的公开发表的公开 数据主要为数据主要为BACBAC 克隆的顺序克隆的顺序, ,共共 4443.3Mb4443.3Mb 随机测序与序列组装方法和 指导测序与序列组装方法 相结合进行序列组装 B 国际人类基因组测序策略 构建BAC克隆 限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的 顺序锚定到物理图上 5.4 人类基因组测序结果 基因数是3万、4万还是10万 人类遗传基因数量比原先估 计的少很多。目前研究表明， 人类基因组中约有3万至4万个 蛋白编码基因，仅仅是果蝇基 因数目的两倍，人有而鼠没有 的基因只有300个。此结论是 由两大科研小组的数据是从 DNA水平上得出的；而“人类有 10万多个基因”则是从RNA水平 上得出的结论。所以，这些数 据不能推翻“人类有10万个基 因”的说法。 人类基因组研究的惊人发现 19号染色体是含基因最丰富的染色 体，而13号染色体含基因量最少 目前已经发现和定位了26000多个功 能基因，其中尚有42%的基因尚不知 道功能 人类基因组中存在“热点”和大片“荒 漠”。在染色体上有基因成簇密集分 布的区域，也有大片的区域只有“无 用DNA” 不包含或含有极少基因 的成分。基因组上大约有14的区域 没有基因的片段。 353的基因包含重复的序列。 这说明那些原来被认为是“垃圾”的 DNA也起重要作用，应该被进一步研 究。 什么是单核苷酸多态性 人类999的基因密码 是相同的，而差异不到0 1，不同人群仅有140 万个核苷酸差异。这些差 异是由“单一核苷酸多样性 ”（SNP）产生的，它构成 了不同个体的遗传基础， 个体的多样性被认为是产 生遗传疾病的原因。在整 个基因组序列中，人与人 之间的变异仅为万分之一 ，从而说明人类不同“种属 ”之间并没有本质上的区别 。 5.5 人类基因组计划的意义 随着人类基因组逐渐 被破译，一张生命之图将 被绘就，人们的生活也将 发生巨大变化。人类基因 研究的意义在于它可以支 持和推动生命科学中一系 列重要的基础性研究。如 基因组遗传语言的破译， 基因的结构与功能关系， 生命的起源和进化，细胞 发育、生产、分化的分子 机理，疾病发生的机理等 。 5.6 人类基因组计划的论理学 A A 个人个人DNADNA顺序的隐私权顺序的隐私权. . 如如:” :”次等次等” ”基因携带者可能受到岐基因携带者可能受到岐 视视, ,职业职业 限制限制, ,医疗保险等问题医疗保险等问题; ; B B 基因专利问题基因专利问题 6. 后人类基因组计划 伴随着人类基因组计划的 迅速进展，基因的全序列逐步 被完整的测出，会出现大量的 不知道任何功能信息的序列。 因此，在HGP完成之后，即全 部人类基因被定序之后，还需 要： n破解贮存于基因组之中的遗传 语言; n识别、分离、鉴定和克隆所有 基因； n搞清每个基因的功能及基因之 间的相互作用和相互关系。 7 水稻的基因组 2002年我国科学家 完成了水稻基因组定序 和初步分析。出人意表 的是，水稻的基因竟比 人类基因还要多得多。 人类基因大约有3-4万个 ，水稻有46022-55615 个基因。因此水稻基因 组可说是继人类基因组 之后，完成定序的最大 基因组，也是至今已知 最大的植物基因组。由 于水稻是全球半数以上 人口的主食，对解决全 球粮食问题具有重要意 义。 本章要点 n链终止法测序 n人类基因组计划 n了解其他基因测序方法和基因拼接方法 本章内容结束谢谢本章内容结束谢谢! ! 第二讲 基因组序列诠释 问题 n基因组序列所包含的全部遗传信息是什 么？ n基因组作为一个整体如何行使其功能？ n用什么方法寻找基因，研究基因地功能 呢？ 主要内容： n寻找基因 n获取基因的全长cDNA序列 n确定DNA顺序中基因的位置 n研究基因的功能 n基因表达 n蛋白质组学 1. 寻找基因 1.1 根据开放读码框预测基因 A 起始密码子 ATG n第一个ATG的确定则依据Kozak规则; Kozak规则是基于已知数据的统计结果， 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱 基分布所满足的统计规律. 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别 标为1,2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含 碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏 好碱基。 n信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5端的Contig翻 译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个 ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果 SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信 号肽; 假如在该测试序列的第一个Met 5端存在终止密 码子，该序列为信号肽的可能性更大。 B 终止密码子 终止密码子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次 ； GC% 50% 终止密码子每100200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因 此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密 码子。 C 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序 列,若测试Contig不含Poly(A)序列，则根 据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST 同源性比较结果共同判断。 D 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少 于100 个密码子，有的不到50个密码子 甚至更少； E 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密 码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。 不同种属间使用同义密码的频率有很大差 异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多 为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。 F 外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征， 如： 内含子的5端或称供体位（donor site）常 见的顺序为 5AGGTTAAGT-3； 3端又称受体位（acceptor site), 多为 5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T 或C)； G 上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控 序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基 因表达。 另外个别生物的基因组特有组成也可作 为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的 上游都有CpG岛。 H 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。 1.2 mRNA的5端即转录起始位点区 通过同