ELISA的基本原理和质量控制.ppt

ELISAELISA的基本原理及质量控制的基本原理及质量控制 The fundamental principle and quality control of ELISAThe fundamental principle and quality control of ELISA ELISAELISA（Enzyme-linked Enzyme-linked immunosorbentimmunosorbent assay assay 酶联免疫吸附实验）酶联免疫吸附实验）是是2020世纪世纪6060 年代发展起来的年代发展起来的免疫学免疫学检测检测检测检测 技术，也是技术，也是目前目前 应应应应用最广泛的用最广泛的传染病检测传染病检测方法方法。 ELISAELISA的特点：的特点： 敏感度和特异度较高，重复性好。敏感度和特异度较高，重复性好。 试剂比较稳定，易于保存。试剂比较稳定，易于保存。 操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。 易于标准化和对检测对象进行定量。易于标准化和对检测对象进行定量。 可以自动化。可以自动化。 ELISAELISA的基本原理的基本原理 抗原或抗体在体外抗原或抗体在体外 结合到某种固相载结合到某种固相载 体表面后，仍然能体表面后，仍然能 保持其免疫学活性保持其免疫学活性 而能相互而能相互特异性特异性结结 合。合。 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原 或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保 留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，留与相应抗体或抗原结合的免疫活性， 又同时保留酶的活性。又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放由于酶具有很高的催化效率，因此可放 大抗原抗体反应效果，从而使测定方法大抗原抗体反应效果，从而使测定方法 达到很高的达到很高的敏感性敏感性。 抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的 底物在酶的作用下显色，底物在酶的作用下显色，颜色的深浅颜色的深浅与与特异性抗特异性抗 体水平体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。成比例关系，可进行定性和定量分析。 间接法间接法ELISAELISA |间接法间接法ELISAELISA（Indirect ELISAIndirect ELISA）将将 特异性抗原包被于固相载体表面，与标本特异性抗原包被于固相载体表面，与标本 中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶 标的抗人标的抗人IgGIgG或或IgMIgM抗体与之结合，洗涤后抗体与之结合，洗涤后 加入底物显色。加入底物显色。 1.加样 2.孵育3.洗涤 4.加入二抗5.孵育6.显色 间接法ELISA 使用RF吸附剂 类风湿因子（10）是一种自身 抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗 体复合物的FC段结合，非特异性IgM 抗体（风湿因子）的存在将导致IgM 检测出现假阳性结果。 麻疹IgG 麻疹 抗原 麻疹IgM 抗人酶标 IgM抗体 类风湿因子 阳 性 结 果 假 阳 性 结 果 RF吸附剂的组成 RF吸附剂人IgG抗体 Protein A 羊抗人IgG 因此，在使用间接法ELISA进行IgM检 测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预 处理 。 捕获法捕获法ELISAELISA |捕获法捕获法ELISAELISA（Capture ELISACapture ELISA）专专 门用来检测门用来检测IgMIgM型抗体的方法。将抗人型抗体的方法。将抗人 IgMIgM抗体包被于固相载体表面，与标本中抗体包被于固相载体表面，与标本中 所有人所有人IgMIgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗体结合，洗涤后加入特异性 抗原与相应的特异性抗原与相应的特异性IgMIgM抗体结合，洗涤抗体结合，洗涤 后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合 ，洗涤后加入底物显色。，洗涤后加入底物显色。 1.加样 2.孵育3.洗涤 4.加入抗原 孵育 5.加入二抗 孵育 6.显色 捕获法ELISA ELISA试剂的组成 固相载体：许多物质可以作为固相载体固相载体：许多物质可以作为固相载体 ，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙 稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是 聚苯乙烯聚苯乙烯材质的微孔板，多为材质的微孔板，多为8 8 1212道道 9696孔板条。孔板条。 吸附能力吸附能力 通透性通透性 均一性均一性 酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不 影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质 、不产生非特异反应。、不产生非特异反应。 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HorseRadishHorseRadish PeroxidasePeroxidase， 简称简称HRPHRP）是目前应用最为广泛的酶，是从）是目前应用最为广泛的酶，是从 辣根菜的根中提取。辣根菜的根中提取。 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline Alkaline PhosphatasePhosphatase ，简称，简称 APAP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提 取工艺复杂，价格比较昂贵。取工艺复杂，价格比较昂贵。 底物：底物：不同种类的酶要求使用不同的底物不同种类的酶要求使用不同的底物。 l l HRPHRP邻苯二胺邻苯二胺（OrthopenylenediamineOrthopenylenediamine，OPDOPD） 、四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TetramethylbenzidineTetramethylbenzidine，TMBTMB） 和和ABTSABTS 2,2-2,2-连氮连氮- -双双-(3-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸乙基苯并噻唑啉磺酸 ) )，OPDOPD为在为在ELISAELISA中应用最多的底物，灵敏度高中应用最多的底物，灵敏度高 ，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用 液后稳定性差。液后稳定性差。TMBTMB经酶作用后由无色变蓝色，目经酶作用后由无色变蓝色，目 测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。 l l APAP对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphatep-nitrophenylphosphate ，p-NPPp-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm405nm有吸收峰。用有吸收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳终止酶反应后，黄色可稳 定一段时间。定一段时间。 洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸 附作用是普遍性的，因此在附作用是普遍性的，因此在ELISAELISA在洗涤在洗涤 时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来 。洗涤是最主要的。洗涤是最主要的关键技术关键技术，应引起操，应引起操 作者的高度重视，应严格按要求洗涤。作者的高度重视，应严格按要求洗涤。 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓 冲液，一般是冲液，一般是吐温吐温2020（聚山梨酯聚山梨酯 ）。 洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。 标本稀释液：用来稀释血清标本，有时标本稀释液：用来稀释血清标本，有时 也稀释酶结合物。也稀释酶结合物。 RFRF吸附剂：在进行吸附剂：在进行IgMIgM抗体检测时，间抗体检测时，间 接接ELISAELISA方法需要使用方法需要使用RFRF吸附剂去除吸附剂去除 类风湿因子的干扰作用。类风湿因子的干扰作用。 ELISAELISA的质量控制的质量控制 及注意事项及注意事项 ELISA质量控制的目的 获得正确的检验结果。 使不同时间和地点的ELISA检验结 果具有可比较性。 ELISA准确度的影响因素 患病率 在检测真正感染疾病患者中，检测 的准确度随着该传染病在人群中的 患病率的变化而改变。 患病率越高，被检测者阳性是真阳 性的可能性就越大。 患病率和阳性预测值患病率和阳性预测值(PPV)(PPV)的关系的关系 患病率 高 低 被检测数量 10000 10000 总阳性数 1000 30 假阳性数量 27 27 真阳性数量 973 3 阳性预测值（PPV） 97.3% 10% PPV=患病率灵敏度/患病率灵敏度+(1-患病率)(1-特异性)100% 解决方法 试剂试剂 1试剂试剂 2 试剂试剂 1+2敏感度 特异度 99.0%99.0% 99.5%99.9% (串联联) 患病率PPVPPVPPV 0.2%28.4%66.4%99.75% 2.0%80.2%80.2%99.97% 20.0%98.0%99.6%99.99% ELISA准确度的影响因素 实验过程 实验操作人员的教育背景和培训 标本的条件 试验过程中的对照 试剂 设备 结果的解释 结果的抄写和报告 ELISA实验过程中涉及的质量控制 仪器 n移液器，ELISA的加样量小，选择量程合适 的加样枪，其准确性直接影响试验结果。定 期进行校准。 n水浴锅，有外部温度计对仪器温度进行校准 。 n洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定 期检查加液孔有无堵塞。 n酶标仪，定期检查。 ELISA的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特 定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基 团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标 记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较 高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与 后面加入的HRP底物反应显色。 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染， 一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗 体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如 大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的 测定方法产生非特异性干扰。 ELISA实验过程中涉及的质量控制 标本 p血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保 存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长 时间保存，应在-70以下。 p冻存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融 。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的 蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此 外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡， 反复颠倒混匀即可。 p标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时 ，应离心沉淀后取上清检测。 p标准操作规程（SOP） p实验纪录 日期 操作人员 试剂批号 试剂有效期 p试剂准备，使用前在室温平衡20min以上， 以便在温育时很快达到反应要求温度，避免 弱阳性标本产生假阴性结果。 p水浴 ELISA实验过程中涉及的质量控制 其它 p试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内 pELISA板的空白对照OD值在控制范围内 p实验室内部质控血清(In- House Control, IHC) 每次试验都要包括一个实验室质控血清。 可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之 后的过程。 确保每次试验操作的正确性和结果的一致性。 尤其是可以监测试剂不同批号之间的差异。 可以做质控图。 ELISA实验过程中涉及的质量控制 内部质控（IQC）包括试剂质控和内部质控血清 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染 的阳性血清，56加热30min灭活。 用0.45um滤器过滤除去污染物和杂质，用 阴性血清、正常人血清或PBS缓冲液将收 集的血清进行一系列稀释。 检测稀释标本并绘制s形标准曲线。 选择Cutoff值1.5至3倍OD值所对应的稀释 度，作为IHC。 一次准备12个月使用量，分装到血清管， 每管30ul，于-20保存备用。 内部质控血清内部质控血清（IHCIHC）的制备的制备 如何用内部质控血清如何用内部质控血清（IHCIHC）做质控图做质控图 在常规试验条件下，将IHC放在常规样本中 ，进行20次检测，计算均值和标准差（SD） 。并绘制质控图。2SD是一般公认的允许误差 限度。每批测定放一份质控血清时： 一次超过2SD但小于3SD作为 “告警” 一次超出3SD、连续二次超出2SD、3-5次连续处 于一侧的2SD之内、57次连续偏向横轴的一侧 ，均为失控 同一批号试剂和质控血清。 举例：质控图 “即刻性”质控 只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控 。“ 即刻法“的建立具体计算方法如下： 1)先将测定值从小到大排列 2)计算X和SD。 3)计算SDI上限和SDI下限值。 4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较 。 当 SDI上限值和SDI下限值n2SD时，表示处 于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复 以上各项计算；当SDI上限和SDI 下限有一值处 于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在 2SD3SD范围，处于“告警”状态；当SDI上限 和SDI下限有一值 n3SD时，说明该值已在 3SD范围之外，属“失控”。数值处于“告警”和“ 失控”状态应舍去，重新测定。 Nn3sn2snn3sn2s 31.151.1512 2.552.29 41.491.46132.612.33 51.751.67142.662.37 61.941.82152.702.41 72.101.94162.752.44 82.222.0317 2.792.47 92.32 2.1118 2.822.50