《色谱柱培训》PPT课件.ppt

色谱柱培训 前言 o色谱柱是HPLC分离过程中的核心。一支稳 定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性 好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱 柱，甚至来源相同，认为完全一样的色谱柱 之间，可能存在很大的差异，尤其是不同色 谱柱在塔板数、色谱峰的对称性、保留值、 峰间距及使用寿命会有所不同，而这些不同 对建立理想的HPLC方法会产生很大的影响 培训内容 o介绍色谱柱担体、固定相以及柱填料信息 o讨论色谱柱使用过程中的问题及适宜的解决 方案 o同时讨论在常规HPLC分析中，为获得最佳 结果，一支“好”色谱柱的重要意义 o色谱柱的结构 色谱柱与柱填料的特性 o柱填料：大多数使用HPLC分离的色谱柱使 用硅胶微粒作为担体。少数为多孔聚合物担 体或者其他材料的担体 o硅胶担体与键合的有机表层应用范围广，重 点讨论 o常见的几种柱填料微粒：实心微球、全多孔 微球、灌注微粒 o实心微球型特点：实心核、起作用的是表面 很薄的外壳、微粒的大小通常为1.52.5um， 快速传质的动力学，对大分子有突出的分离 效能；表面积较小，样品容量有限，仅适用 于分析型HPLC；峰型尖锐，要求HPLC仪器 的柱外峰展因素极小，避免峰展宽 o灌注色谱柱填料：包含孔径达40008000的贯 穿孔，贯穿孔中有较小的内联孔（如3001000 ）；高流速时，对流与扩散作用共同作用，进入并 离开孔结构，减小了峰展宽，柱效与小微粒相当， 但压力降却小许多。 o使用范围：大分子如蛋白质的制备分离，小分子较 少 o插入色谱柱的参数意义：ID&4.6mm o颗粒（粒度）的大小在HPLC中极为重要。 约5um的微粒直径很好的兼顾了分析柱的柱 效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3um ）对快速分离很有效。 o较窄的粒度分布（50%均值）能保证填 充柱的稳定、高效和压力降最小 硅胶填充微粒 o物理特性：机械强度很高，可保证填充柱长 时间在很高的操作压力下工作，柱效稳定； 使柱的反压较低，寿命较长。 o制作工艺：良好的控制制作工艺，能够得到 平均孔径变化范围宽（如8、30、100um ）、孔径分布范围较窄和粒度选择较大（如 10、5、3um）的填料。能满足大、小分子 的分析和制备 o硅胶担体的表面性质极为理想，其表面可以 通过化学改性引入种类繁多、具有不同官能 团的键合相 o硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容，更 换溶剂时，填料大小不会变化（例如溶胀） 。这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以 及使用梯度洗脱期间，仍保持稳定 o硅胶担体并非完美无缺：在pH8.0以上条件 下，硅胶能溶解；硅胶表面显酸性，不适宜 于碱性物质的分离 o插入硅胶溶解曲线 o硅羟基一般存在三种类型 o自由或孤立（无氢键键合）的硅羟基一般产 生于低浓度中。含自由、酸性硅羟基浓度高 的硅胶往往使碱性物质的保留值增加，峰变 宽、拖尾。 o完全羟基化的硅胶基质填料，具有高浓度成 对的与缔合的硅羟基，最有利于碱性物质分 离。（查成对硅羟基的酸性） o硅胶担体的纯度对许多极性化合物的分离极为重要 。某些硅胶被一定的金属污染（Al、Fe、Zn、Ni 等） o这些金属杂质能与螯合溶质络合，引起不对称、拖 尾色谱峰，甚至化合物被完全保留，不能洗出 o硅胶晶格中的其他金属（尤其是铝）能使表面硅胶 硅羟基活性增强，酸性增强 o建议：采用色谱级试剂！ 硅胶分类 oA型硅胶：过去纯度不高的硅胶，适用于分 离中性和非电离的化合物 oB型硅胶：新型高纯度的弱酸性硅胶，一般 对离子或可电离的化合物，尤其是碱性物质 的分离较好 oB型硅胶的意义：见FDA批准的化药碱性药 物表 多孔聚合物填料 o优点：聚合物微粒有些是疏水性的，可直接 用于反相，不需添加表面涂层；在pH113 均可用；很强的疏水保留性（相对于硅胶基 质的C18柱） o缺点：柱效低，一般不到类似的硅胶基质色 谱柱的一半；在不同有机溶剂中溶胀程度不 同。 o使用范围：非常适用于蛋白样品的分离 其他无机填料 o石墨碳 o氧化铝 色谱柱的结构 o不锈钢柱管：可用于所有的有机溶剂与大多 数水性缓冲液，然而含氯的流动相会缓慢地 “卤素腐蚀”不锈钢柱管，尤其是低pH条件 下 o柱管不锈钢成分（铁、镍、铬）牢固络合的 样品可能发生这类问题，但因为色谱柱内壁 的表面积很小，发生不良反应的机会不大 o多孔烧结物（滤片）：封闭色谱柱的两端， 固体色谱柱的填料 o一般来说，5um与3um的微粒分别用2um 与0.5um孔径的不锈钢滤片 o发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多 o峰型不好与样品回收率低可能预示滤片出现 问题 o压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑 性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制 成，用于固定筛板。 o密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多 为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与 柱外壁的密封。 o接头：柱两端连接流动相与柱管的中空环套 ，由不锈钢制成。用于柱管路联通与柱端高 压固定。 o封头：柱两端的密封螺丝，用于保存色谱柱 时封头。 o柱填料 固定相 o键合硅胶：在硅胶担体表面上共价键有机硅 烷或沉积聚合物有机涂层 o使用最广泛的有机硅烷键填料的表面反应式 见下图： 结论 o多官能团键合相与单官能团的键合相相比： 多官能团键合相在低pH条件下，它更稳定 ；但多官能团键合相的保留值与选择性却更 不稳定 o单官能团硅烷反应的优点：重现性好，一个 硅羟基与一个硅烷分子反应，产生可预测的 结构，柱效最高 o键合相配体的空间位阻效应，表面的硅羟基 不能完全参与反应 o随链长或者硅烷体积的增大，参与反应的硅 羟基比例相应的减少 o即使最小的硅烷（三甲基或C1），其表面 上也有近50%的硅羟基未被反应 o封尾：指键合填料与小硅烷进行后续反应， 如三甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷等。反应 掉残余的硅羟基，增加担体覆盖率，尽量减 少与溶质发生不良反应。 o缺点：在低pH（pH3）反相分离中，极 易从填料上水解 RPC中键合相的保留行为 o键合相填料的有机物含量（如百分含碳量）大致能 说明一特定色谱柱的保留能力 o键合相担体的表面积是一主要因素：表面积越大， 保留值k越大 o样品保留值一般随键合碳链长度而增加（ C18C8C3C1），但长链之间的差别并不大 （即C8C18） o键合相可将样品的保留值控制在一定范围内，但随 着填料的表面积与所用硅胶担体类型的改变而变化 （柱间差异） 键合相色谱柱的稳定性 o相同情况下，长链的烷基键合相填料（如 C8、C18）一般比短链的键合相更稳定 实例 结论 o试验证明：长链的C18与C8配体明显更稳 定（键合相流失引起的保留值变化不大） o随着链长度的减小，固定相的稳定性也降低 o这是许多用户喜欢用他们的原因之一 o硅胶基质键合相的稳定性（寿命）与硅胶担 体和键合相的类型有直接的关系 o色谱柱稳定性也很大程度上取决于流动相的 pH，所用缓冲液与有机溶剂的种类 o硅烷键合相的损失归咎于将硅烷键合于担体 上的Si-O-Si键的水解，高温、低pH及水比 例高的流动相中，离解加剧，而这些又是对 许多样品分离较好的条件。 o改善硅烷固定相在低pH条件下稳定性的另 一个方法：使用空间保护官能团。 o有空间保护的硅胶基质固定相的稳定性很高 o实例 o色谱条件： o尽管大多数分离在低pH条件下进行最好（ pH3），但有些分离须在高pH条件下进行 o原因： o有关化合物在低pH条件下不稳定 o在低pH条件下，达不到所需选择性 o质子化的（亲水的）碱性化合物子低pH条 件下保留太小 o柱填料封尾可以减少硅胶基质色谱柱在在中 等与高pH条件下，硅胶担体溶解 o实例 o色谱条件： 结论 o小分子封尾硅烷在硅羟基加成反应产生了疏 水层，有效延缓硅胶担体的溶解 建立pH7.0以上的普适性方法的策略 o保留值与选择性变化的原因： o硅胶担体不同 o硅烷的选择性：单官能团或多官能团 o键合的彻底性：部分反应或完全反应 o是否封尾 o键合化学 o担体表面积 o任何情况下，在规定的色谱柱上建立的方法 ，都应该用至少两个其他批次柱进行证实后 ，才可采用！ o不同厂家的同种色谱柱很少得到相同的分离 ！（迪马、菲罗门、安捷伦） 色谱柱的性能指标 o色谱柱的有关要求： o某指定k值的塔板数 o峰不对称因子As（或者拖尾因子） o两种不同溶质的选择性 o色谱柱的反压 o保留值k的重现性 o键合浓度 o色谱柱的稳定性 o塔板数N：产生尖锐、窄谱峰，以及小值 时色谱峰达到良好分离度的能力 峰不对称与拖尾 o峰不对称与拖尾能导致： o塔板数与分离度测定不准 o定量不准 o分离度降低与峰尾中的小峰检不出 o保留值的重现性不好 o理想柱的色谱峰As值为0.921.1（绝对对 称峰的As值为1.0） o峰不对称性与拖尾因子的计算 o色谱柱失效：色谱柱的寿命应有多长？ o如果塔板数下降50%或分离度约降至四分 之三，则可能需要更换色谱柱。 o建议：建立色谱柱信息台账，对色谱柱的塔 板数、拖尾因子、分离度、柱压、保留值、 进样时间进行登记。发现色谱柱可能失效， 提前申报采购。（记录最后一针的色谱信息 即可） 色谱柱问题与解决方案 o保留值与分离度重现性不好的可能原因： o解决有关重现性不好问题，通常有以下几点 ： o在整个应用中都采用同一固定相、粒度和柱 尺寸 o选择良好的流动相，尽量减小硅羟基效应 o确保流动相充分平衡色谱柱 谱峰拖尾 o当出现拖尾峰时，估算柱塔板数与分离度是 将偏高 o对于不对称因子为1.2的峰（峰拖尾因子约 为1.5），用半高峰宽方法计算使塔板数偏 高30%，计算分离度的误差高达15%！ o如果用中性化合物测试新柱，如显示峰严重 不对称，不可用于方法建立！ o拖尾峰常见于使用过度的色谱柱柱口赃物 或塌陷，部分堵塞进口滤板 o填补柱塌陷对价值较高的色谱柱最实用（手 性柱、制备柱） o在建立常规分析方法时，用保护柱可以减小 强保留样品组分积聚可能性的有效方法 o注入的样品溶剂强度大于流动相时，往往会 造成早流的色谱峰变形和拖尾 实例 o并非适用于所有的情况，例如阿奇霉素肠溶 干混 o对于难溶性的物质，可以先用强溶剂溶解后 ，再同流动相稀释 o与HPLC设备有关的柱外效应可以引起峰拖 尾与色谱峰变宽： o进样体积过大 o进样阀、色谱柱及检测器之间的管线体积过 大 o检测器流动池体积过大 实例 o建议： o进样体积要小（一般25uL） o进样阀与色谱柱，色谱柱与检测器之间用细 内径的短连接管线（例如，20cm,内径为 0.07cm） o确保所有管线用匹配的接头正确连接 o使用易清洗、体积小的检测器流通池（ 8uL） 色谱柱寿命 o色谱柱失效的原因： o进口滤片或柱床部分堵塞 o吸附有赃物 o柱填充不良 o机械及热冲击造成空洞 o担体或固定相遭化学侵蚀 o色谱柱将失效的一些症状： o柱压增高 o色谱峰拖尾 o塔板数下降 o选择性下降 o保留值减小（碱性化合物的保留值增大） o色谱柱滤板问题： o往往是部分堵塞滤片或色谱柱进口处的凹陷 o密封垫与转子磨损造成的微粒是堵塞滤片的 主要来源；定期更换泵密封垫与进样阀转子 一般能减少滤片的堵塞 o温度对色谱