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高效快速的点突变方法高效快速的点突变方法 陈 严 姜 明 汤 敏谦 宝生物工程（大连）有限公司,116600 目的：目的： 1. 1.在目的基因中的特定位点导入突变，包括：在目的基因中的特定位点导入突变，包括： 碱基缺失 碱基置换 碱基插入 2. 通过突变基因的表达，可以为蛋白质结通过突变基因的表达，可以为蛋白质结 构及功能的分析和改造提供有效途径构及功能的分析和改造提供有效途径。 TaKaRaTaKaRa用于定点突变的试剂盒用于定点突变的试剂盒 MutanMutan-Express Km Kit-Express Km Kit MutanMutan-Super Express Km Kit-Super Express Km Kit MutanMutan-K Kit-K Kit TaKaRa TaKaRa MutanBESTMutanBEST Kit Kit MutanMutan-Express Km-Express Km 原理：原理：ODAODA法法 E.coli BMH71-18 mutS、MV1184 Competent Cell or Electro Cell 导入变异Primer 材料与方法材料与方法 MaterialsMaterials ProtocolProtocol Reaction Mixture Annealing/Extension DNA Sample Transformation（1） E.coli BMH71-18 mutS Plasmid Miniprep DNA Transformation（2） MV1184 Colony Sequencing MutanMutan-Super Express Km-Super Express Km 原原 理：理：ODA-LA PCRODA-LA PCR法法 E.coli MV1184 Competent Cell or Electro Cell pKF18k/pKF19k DNA 导入变异用寡聚核苷酸（5-P） 材料与方法材料与方法 MaterialsMaterials Reaction Mixture PCR反应 DNA精制 Transformation sup0 菌株（MV1184） Sequencing Colony ProtocolProtocol MutanMutan-K-K 原理：原理：KunkelKunkel法法 材料与方法材料与方法 E.coli BMH71-18 mutS 、 CJ236 、MV1184 Competent Cell or Electro Cell 导入变异用寡聚核苷酸 M13 mp18 RF or M13 mp19 RF or pUC118/119 MaterialsMaterials ProtocolProtocol Cloned DNA（M13） Transfection CJ236 ssDNA Sample 变异用寡聚核苷酸 5磷酸化 Annealing Extension DNA Sample Transfection BMH71-18 mutS Phage Transfection MV1184（ung+ Cell） 噬菌斑 TaKaRaTaKaRa MutanBEST MutanBEST 原理：原理：PCRPCR法法 材料与方法材料与方法 导入变异用Primer E.coli JM109 Competent cell MaterialsMaterials ProtocolProtocol Reaction Mixture PCR反应 电泳回收PCR Fragment BKL反应 DNA Sample Transformation（JM109 ） Sequencing Colony TaKaRa TaKaRa MutanBEST MutanBEST KitKit使用实例使用实例 5 GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG 3 3 CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGAC 5 pUC118 引入点变异区域碱基序列 GGATCCTCTAGAGTCGACCTG CTTAAGCTCGAGCCATGGGCC Primer 1 Primer 2 Step I . PCRStep I . PCR反应反应 10Pyrobest Buffer dNTP Mixtrue（各2.5 mM） Primer 1 Primer 2 Template Pyrobest DNA Polymerase (5 U/ml) 灭菌蒸馏水 up to 5 l 4 l 0.21.0 M(final conc.) 0.21.0 M(final conc.) 1 g 0.25 l 50 l 94 30 sec 55 30 sec 72 5min 30 Cycles PCR Fragment 10Blunting Kination Buffer Blunting Kination Enzyme Mix. ddH2O up to 2 l 1 l 20 l 0.2-20 pmol Step Step . Blunting . Blunting KinationKination Reaction Reaction 37，10min. Step Step . . Ligation Ligation Reaction Reaction DNA Fragment 5l Ligation Solution I 5l 16,1hr Transformation JM109 Colony Sequencing 结果结果： 1. TransformationTransformation 2. SequencingSequencing 挑取10个蓝色菌落进行测序，证