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文档简介

定点突变技术 基因突变包括单个碱基或片断的替换， 基因片断的插入与删除等 根据其特点可将基因突变技术分为两大 类： 位点特异性突变 定点突变 随机突变 定点突变的研究意义 1 对调控区进行突变 研究基因结构与功能之间的关系 2 对编码基因进行突变 检验特定残基在蛋白质结构、催 化活性和配基结合能力中的作用 。 获得突变蛋白。 位点特异性突变的类型 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱 基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作 用下启动DNA分子进行复制。 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变 序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相 应序列。 PCR介导的基因突变 Kunkel 法 在E. coli中 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut- ） dUTP dUMP 在正常情况下，尿嘧啶糖基化酶(ung-)可以去除掺入DNA中的 尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 因此 在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的M13噬菌体的DNA中将含有20 -30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除， DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级 原理 Kunkel 法小结 用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探 针标记来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列 分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂 交程序。 此法的成功关键，是要得到好的含单链模 板DNA。 （可用含有目标基因的M13双链DNA 载体感染E. coli CJ236品系，其为dut- ung- 菌株） Oligo诱导突变的改进方法 武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导 突变方法进行了改进。2-3个核苷酸 替换的突变频率可达80%-85%，即使 是需要有道连续4个氨基酸缺失，突 变频率也高达40%。 原Kunkel 法 改进后的方法 DNA聚合酶和T4 连接酶 同步加入 分级退火，冰浴稳固异 源双链再加T4 连接酶 直接用反应混合物转染经酚-仿抽提后再进行 转染 转染效率：3个空斑转染效率：78个空斑 PCR介导的基因突变 在基因5和3 末端产生突变 重叠延伸PCR 大引物PCR法 重叠延伸PCR法小结 缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且 需要对中间产物进行纯化。 优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高 ，因此运用非常广泛 同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中 心区段进行取代、插入、缺失的突变 各种方法的比较 寡聚核苷酸介导的突 变 盒式突变PCR介导的突变 优 点 保真度高 简单 易行 突变效率高 操作简单 突变成功率高 缺 点 操作复杂 周期长 合成多条引物成本 高 受到酶切位点的限 制 后续工作复杂 TapDNA聚合酶 保真性偏低 应用 一步反向PCR法 Stratagen公司的 Quickchange试剂盒 一种简便快速的定点突变的方法 Stratagen公司研
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