课题申请书-肾素血管紧张素系统免疫调节机制及其对肿瘤免疫研究.doc

题目：肾素血管紧张素系统免疫调节机制及其对肿瘤免疫的作用摘要：肿瘤通过免疫逃避机制引起T淋巴细胞凋亡和增生受抑，而组织肾素血管紧张素系统(RAS)对多种组织细胞的增生和凋亡有重要的调节作用。本课题从时间动力学角度，以T细胞激活诱导的凋亡（AICD）为重点，分析RAS在细胞免疫中的表达变化、RAS对细胞免疫的调节作用及其作用机制，随之初步探讨干预RAS抑制肿瘤细胞引起的T淋巴细胞AICD的可能性。为细胞免疫和肿瘤免疫的调节提供新的思路。研究意义肿瘤的发生、发展和消退取决于与机体免疫系统的相互作用，研究肿瘤免疫的机制和影响因素，对于明确肿瘤的发生，和发展合理的免疫治疗方案均有重要意义。本项目旨在对于肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）这一调节包括细胞增生和凋亡等多种重要功能的系统，研究其免疫调节作用和机制，并初步研究RAS对于肿瘤免疫的作用。本项目的思路如图：机体对肿瘤的免疫反应主要是T细胞介导的细胞免疫反应，虽然多种肿瘤特异和肿瘤相关抗原已经分离鉴定，肿瘤免疫反应的先决条件已经具备，但在大多数情况下，机体对肿瘤的免疫反应是无效和微弱的。主要原因是肿瘤在与机体的对抗和选择过程中发展的免疫逃避和免疫抑制机制：1）肿瘤低表达MHC I，不表达MHC II和共刺激分子配基如B7; 2)肿瘤抗原的丧失和遮蔽；3)肿瘤分泌免疫抑制因子如TGF-beta,IL-6和IL-10；4）肿瘤诱导免疫耐受；5）肿瘤或者通过表达FasL，直接杀伤激活的T淋巴细胞，或者通过重定向细胞免疫（TH1-TH2）、激活NK1.1+/CD3+细胞等机制间接诱导T淋巴细胞通过AICD凋亡。虽然肿瘤的免疫豁免机制复杂多样，最终结果是肿瘤特异性的T淋巴细胞的增生受抑和凋亡，从而导致对肿瘤的免疫无反应性1。调节T细胞的增生凋亡是调节肿瘤免疫的一个重要靶点。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）是机体进化过程中高度保守的内分泌网络，其对血压和水钠储留调节的传统的生物学功能已为人们所熟知，但愈来愈多的研究表明RAS具有广泛的生物学功能，而“组织”RAS在局部表达通过自分泌和旁分泌作用，对细胞分化、增殖和凋亡的调节作用成为研究热点2。RAS的促进增殖和凋亡的作用已在包括心肌细胞、神经细胞、嗜铬细胞、成纤维细胞以及多种上皮来源细胞如血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等细胞组织证实3。在细胞免疫中，T淋巴细胞已证实表达RAS的各组成成分，组织RAS起作用的先决条件已经具备；血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖和在混合淋巴细胞反应中增殖4，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡, 在一些免疫介导的炎症中起保护作用5，提示RAS对T淋巴细胞的增生和凋亡这两种看起来截然相反的过程均有重要的促进作用。在细胞免疫中，机体对免疫细胞的增生和凋亡的调节体现在克隆选择和时间动力学控制上。正常的免疫反应是一个多阶段的过程，在免疫反应中，T细胞通过抗原识别和TCR/CD3信号，通过JAK/STAT、calcineurin/NFAT、MAPK等多种信号传导途径，引起T淋巴细胞激活、增生和细胞因子分泌；同时，Fas/FasL，CTLA-4等表达增加，Bcl2/Bax、FLIP等凋亡抑制因子下调，凋3亡敏感性逐步增加，使激活的T细胞发生凋亡6。在细胞周期中，TCR/CD3信号引起细胞周期的进展和细胞激活增生，而进入G1A但不能通过G1/S调定点的细胞将通过AICD凋亡7。机体通过对信号传导通路和细胞周期的调控，使细胞的表型和细胞因子分泌、关键细胞蛋白发生有序变化，从而实现免疫细胞增生和凋亡的精确调控，既保证免疫反应，又避免免疫反应过度，保持免疫稳态。(如图：)： RAS能通过多条信号传导通路发挥作用，在T淋巴细胞可能影响calcineurin/NFAT途径4。RAS信号传导与TCR/CD3信号的相互作用（拮抗和协同/相加）和其作用时T细胞所处的状态，将决定RAS调节凋亡和增生的方向。我们设想RAS对免疫的调节作用，不在于它能调节免疫细胞的增生还是凋亡，而在于RAS调节增生和凋亡作用是否和正常免疫反应的动力学相吻合，从而决定RAS起促进或抑制作用。当然，此设想过于简化，但是，从时间动力学角度，分析RAS在细胞免疫反应的不同阶段，尤其是在细胞激活增生阶段和AICD凋亡阶段的作用，将对正确理解RAS免疫调节作用有重要意义。而最新研究血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖，和在混合淋巴细胞反应中增殖，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡，提示RAS信号和正常的免疫反应CD3/TCR信号和时间动力学能起协同作用。本项目1）以人周围血T淋巴细胞为实验对象，以CD3/TCR信号刺激T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，从时间动力学角度，力图从总体上把握RAS对细胞免疫的调节作用。2）重点分析RAS对T细胞AICD的调节作用，初步分析RAS对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。从动力学角度分析RAS对T淋巴细胞增生和凋亡的调节作用，有助于真正明确RAS的免疫调节作用和机制，从而为发展新的免疫调节手段开辟途径。由于包括胃癌和肝癌等多种肿瘤组织低表达或不表达RAS8,多种成熟的和高特异性的RAS干预手段和药物的存在，预示着调节RAS在调节肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗方面的广泛前景。国内外的研究现状RAS在心肌细胞、血管内皮细胞和肺泡上皮细胞等多种组织和细胞的增生和凋亡调节作用及其信号传导通路已进行了深入研究，证明RAS对细胞增生和凋亡起重要调节作用。近两年来RAS对免疫的调节作用逐渐引起重视，目前已经证明：1）T细胞和巨噬细胞表达RAS各组成成分；2）血管紧张素II能通过AT1受体促进T细胞增殖 ，敲除小鼠AT1受体能阻断ANGII的作用；3）血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡；4）血管紧张素转化酶抑制剂对免疫性炎症有保护作用; 5)RAS参与T细胞的calcineurin/NFAT信号传导通路。但尚有几个关键问题没有解决：1）大多数实验结果来源于动物实验；2）大部分研究局限于血管紧张素转化酶抑制剂，而未对RAS进行系统性的研究。3）虽然提示RAS对T细胞的增生凋亡均有促进作用，但未阐明RAS如何调节淋巴细胞增生和凋亡这两种看起来相反的作用，以及RAS对细胞免疫调节的最终效果；4）未阐明RAS调节淋巴细胞功能的信号传导通路和细胞周期的调控机制。RAS在肿瘤免疫方面的研究国内外尚是空白。 3 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标1） 检测RAS各组成成分在淋巴细胞的mRNA和蛋白表达。2） 从时间动力学角度，以T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，在免疫反应的包括：静止-激活（细胞因子分泌）-增生/分化-免疫下调（细胞凋亡和记忆细胞形成）过程中的不同阶段，分析 RAS的表达变化，分析RAS对T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡（AICD）的影响。3） 探讨RAS对T淋巴细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。4） 检测RAS在肿瘤细胞中的表达，初步探讨RAS对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。研究内容1） 收集健康志愿者新鲜周围血PBMC，采用CD3单克隆抗体刺激T细胞，辅以IL-2，制作T细胞多克隆激活免疫反应和AICD的模型。根据T细胞的表型（phenotype：包括细胞因子分泌情况和表面分子marker的表达）对免疫反应进行分期。2） 分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响，明确RAS免疫调节作用的时间动力学。在T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段：a) 定性和定量测定RAS组成成分（血管紧张素原、AngII和AT1受体）的表达及其变化情况。b) 采用AngII、ACEI(包括Captopril和Enalapril)和AT1受体特异阻断剂（Losartan）在不同层次上对RAS进行干预，分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响。3） 从细胞信号传导机制明确RAS的对T细胞凋亡和AICD的调节机制。检测T细胞两条主要凋亡通路的关键信号传导分子：Bcl-2(线粒体/细胞色素C凋亡途径)，FLIP（AICD，Fas/FasL介导的细胞凋亡途径），分析RAS调节何种T细胞凋亡通路，及其在传导通路上的调节作用点。4） 收集同一肿瘤患者的PBMC和肿瘤切除标本中的肿瘤细胞并培养，定性定量测定肿瘤细胞的RAS组成成分表达。制作MHC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型，分析RAS对肿瘤诱导T细胞AICD的调节作用。拟解决的关键问题：1） 明确RAS在免疫反应不同阶段的作用，在免疫反应过程中的免疫调节作用的动力学，以及RAS免疫调节作用的综合效果。2） 明确RAS对T细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。3） 制作MHC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型。4） 合理选用RAS干预手段，调整RAS调节细胞免疫调节肿瘤免疫。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法a) 细胞生物学方法：肿瘤细胞的培养；人周围血T淋巴细胞的分离、纯化、培养和激活。b) 分子生物学方法：免疫组化、RT-PCR、western blot、Northern Blot定性定量测定c) 免疫学方法：流式细胞仪测量细胞周期、双染色测定细胞凋亡；H3摄入测定细胞增生活性，JAM-Test定量测定细胞凋亡；免疫荧光法测定Caspase3活性。肿瘤细胞/淋巴细胞混合培养。技术路线分为两部分，两部分有交叉5实验方案说明：可行性分析本课题思路明确，技术路线可行，课题组成员均参加过省部级项目研究，具备相关实验技术和方法；已熟练掌握课题中所需要的细胞分子生物学技术，免疫学技术，流式细胞术，而且大部分技术在以往或正在进行的项目中使用；本课题组具有治疗普外科肿瘤包括胃癌、肝癌的丰富临床经验，在胃癌的免疫治疗方面较有心得。以上情况说明我们有能力在此领域开展深入研究。本项目的创新之处：1. 率先开展对组织肾素血管紧张素系统对细胞免疫的调节作用的深入研究，结合细胞满意动力学分析明确RAS的免疫调节作用，并深入研究起作用的信号传导和细胞周期调控机制。目前尚未发现对RAS免疫调节作用较为系统的研究及相关文献。2. 率先开展RAS对肿瘤免疫调节作用的探讨，本研究可能的RAS干预方法机制调节肿瘤免疫。目前国内外在此方面尚是空白。4. 年度研究计划及预测进展2003年1月2004年12月：收集胃癌、肝癌组织标本。测定肿瘤组织RAS表达与正常组织的差别。2003年1月2003年5月：人周围血淋巴细胞RAS表达的检测2003年3月2003年7月：完成Northern Blot、western Blot、RT-PCR等检测技术、CD3抗体/IL-2激活淋巴细胞、增生和凋亡检测等的技术考核。2003年8月2004年3月：完成RAS对免疫细胞增生、凋亡和细胞因子分泌的作用检测。2004年4月2004年5月：阶段总结，合理调整思路，准备对RAS调节机制的研究。2004年5月2004年12月：RAS免疫调节细胞信号传导通路的研究。2005年1月2006年5月：RAS免疫调节细胞周期调控的研究。2005年6月2005年9月：RAS对肿瘤免疫调节的初步研究。2005年10月2005年12月：统计数据，结合分析得出结论。5. 预期研究成果1）明确RAS在T淋巴细胞表达情况。2）明确肿瘤细胞RAS表达的变化。3）明确RAS在免疫反应不同阶段和过程中的免疫调节作用的动力学。4）与正常细胞免疫动力学结合分析，得出RAS免疫调节作用的综合效果。5）采用合理的RAS干预手段，能调节RAS调节细胞免疫。6）采用合理的RAS干预手段，能调节RAS调节肿瘤免疫。课题类别卫生厅编号湖南省医药卫生科学技术研究课题计划（合同）申 请 书课题名称：脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值及临床意义的研究 湖南省卫生厅一九九三年十月制简 表研究课题名称(25字内)脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值 及临床意义的研究 类别A.重点 B.一般 C.青年基金申请金额 2万元起止年月起2002年10月止 2003年9月申请者姓名性别男出生年月 1966年7月专业技术职务主治医师学位博士所在部门工作单位名称所在地性质A.高等院校 B.医疗卫生单位 C.科研单位 D.其它课题组总人数高级中级初级辅助人员博士硕士学士参加单位数52212211 课题组主要成员含负责人姓名年龄专业技术职务年参加月数工作单位项目中的分工签章35主治医师全程负责44副主任医师全程协作40主任医师全程负责31主管技师全程协作28医师全程协作-1-研究内容和意义摘要200字内脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。Tau蛋白是脑细胞内的一种功能蛋白，有形成细胞骨架、组装和稳定微管的作用。正常脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点很少，因而不易被磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量较少。AD患者脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点增多，Tau蛋白呈异常磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量增多。本研究拟采用放射免疫法检测不同年龄段人群（包括痴呆和非痴呆）脑脊液40、A42和Tau蛋白含量，通过大样本的分析，界定其参考正常值范围，为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。-2-一 本研究的立项依据和目标本课题研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在问题，列出主要参考文献随着社会人口逐步进入老龄化阶段，Alzheimer病（AD）已成为人类的第四大死因。AD的研究具有重要的经济意义和社会意义。目前AD的诊断主要靠临床表现、神经心理学测试和影像学检查，缺乏客观的实验室诊断依据。AD的基本病理变化是老年斑和神经元纤维缠结，前者的主要成分是淀粉样蛋白（A），后者的主要成分是Tau蛋白。AD患者脑脊液中A水平是增高还是降低，各家报道不一致1-4。其原因主要与没有分别测定A40、A42和总A有关；且因均采用ELASA法，测出的结果受主客观影响较大，致使A测定的应用价值降低。AD患者脑脊液Tau蛋白水平是增高的，国内外报道是一致的5-6。由此推断：脑脊液Tau蛋白和A联合测定可能会提高实验室诊断AD的应用价值。虽然，国外新近有脑脊液Tau蛋白和A正常值的报道7 ，但目前尚无国人脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值。界定国人的脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值可为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。参考文献1 丁新生，程虹，张雪玲，等。脑脊液中淀粉样蛋白检测对老年期痴呆的诊断意义。临床神经病学杂志，2001，1：3-5。2 吴恺，胡刚，国泓，等。Alzheimer病患者脑脊液淀粉样蛋白的检测。中华老年医学杂志，1999，1：13-15。3 王磊，袁锦楣，郝洪军，等。Alzheimer病血清和脑脊液-淀粉样蛋白的测定。中国神经精神疾病杂志，1999，2：102-103。4 Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et al.Longitudinal study of cerebraospinal fluid levels of tau, A1-40,A1-42(43) in Alzheimers disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:17-26.5 王琨，丁新生，程虹。阿尔茨海默病患者脑脊液Tau、A1-40、A1-42（43）蛋白测及其临床意义。徐州医学院学报，2000，2：109-112。6 Shoji M,Matsubara E,Kanai M,et al.Combination assay of CSF tau , A1-40 and A1-42 as a biochemical marker of Alzheimers disease.J Neurol Sci ,1998,2:134-140.7 Sjogren M,et al .Tau and Abeta42 in cerebrospinal fluid from healthy adults 21-93 years of age:establishment of reference values .Clin Chem 2001;47(10):1776-81.-3-2研究内容、研究目标和拟解决的关键问题研究内容、研究目标： 本研究拟通过对不同年龄段非AD和AD病人脑脊液中 A40、A42和Tau蛋白的检测，确定脑脊液中A40、A42和Tau蛋白的参考正常值。为AD的诊断提供实验室依据。拟解决的问题：理论上说，只有痴呆患者（包括AD性和非AD性）的脑脊液A和Tau蛋白异常，正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病患者脑脊液中A40、A42和Tau蛋白含量是一致的。但为证实这一理论，先将非痴呆组分为正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病三个亚组的脑脊液分别检测，如这一理论得到证实，则将这三个亚组的脑脊液A和Tau蛋白的含量视为正常人的含量来分析，以增加样本量，克服真正的正常人脑脊液来源不足的弊端。 -4-3本课题的特色和创新之处及立论根据（与国内外类似研究比较） 脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下腔内的一种无色透明液体，脑细胞的代谢产物可释放到脑脊液中，脑脊液中成分的变化一定程度反应了脑细胞的活动情况。脑脊液取材操作简单，放射免疫法检测受主观干扰因素少，结果可靠。 目前，国内外关于脑脊液A和Tau蛋白检测的报道主要是对已确诊为痴呆的研究，对非痴呆患者脑脊液Tau蛋白和A的检测的报道甚少。本课题拟通过对非痴呆患者的不同人群脑脊液A和Tau蛋白含量的研究，界定其参考正常值，为确诊AD提供实验室依据。 4研究工作的预期结果或成果 预期通过对不同年龄段的非痴呆人群脑脊液Tau蛋白和 A的检测，界定其人群的参考正常值。 -5-5本课题的情报查新情况及结论 检索关键词（个）： 检索年限（前3年以上）： 检索刊物名称（至少有种系国外刊物）： 检索手段（光盘、手工、其它）： 检索结论： 检索机构及检索人盖章-6-二、研究方法和路线、 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证方法、步骤、技术路线：1） 脑脊液的收集：包括所有行腰穿（神经内科和非神经内科住院患者）时的脑脊液，除外有明显出血的脑脊液，经离心沉淀后分管于-20冰箱中保存待测。根据痴呆的临床诊断标准分为痴呆组和非痴呆组，然后再分亚组。详见表。 AD 痴呆组- 非AD 正常人 非痴呆组-非神经系统疾病 非痴呆神经系统疾病 2） 选用相应的试剂合，用放射免疫法测定。3） 实验数据的分析、处理。4） 书写论文。可行性、可靠性论证： 1） 腰穿留取脑脊液化验检查是神经内科诊断疾病常用的方法，因而收集足够的脑脊液是可行的。2） 本院核医学科有一流技术的医技人员和成套设备，能够完成该科题的实验检测。3） 试剂合可在国内外生物技术公司购买。 -7-2、研究工作的总体安排及进度： （1）2002年10月-2003年3月 规范实验程序，收集标本。（2）2003年4月-2003年6月 购买试剂，实验阶段。（3）2003年7月-2003年9月 实验数据处理，结果分析，撰写论文。-8-三、实现本课题预期目标已具备的条件1与本课题有关的研究工作基础 本研究负责人在读硕士研究生期间（1997.92000.7）曾参加国家“九五”攻关课题Alzheimer病的流行病学调查，与该课题密切相关。2实现本项研究已有的主要仪器设备，尚缺的仪器设备及解决途径本院核医学科有成套的仪器设备，已开展放射免疫检测多年，不缺任何仪器设备，只需购买相应的试剂合。3课题负责人及主要成员的学历和研究工作简历，已取得的主要科研成就 4不需动物实验-9-四、申请课题经费预算预算支出科目金额（万元）计算根据及理由合计21、科研业务费2、实验材料费3、小型土建安装费4、协作费0.510 0.5调研费 万元；业务交流费 万元；培训费 万元。编程软件材料费 万元；资料、书籍购买费 万元直接主管部门开户银行及帐号：主要研究单位开户银行及帐号-11-五、合作单位意见（一）同意申请书的内容并做到：1、保证参加合作研究的人员、物力和时间：2、督促课题参加者按计划完成所承担的研究工作，并按时报送有关报表（二）需要说明的其它问题：合作单位1（公章）合作单位2（公章）合作单位3（公章）合作单位4（公章）-12-六、申请单位学术委员会审查意见（对本课题的意义特色和创新之处，研究方法的先进性、可行性及研究者素质水平等签署意见）本研究课题紧密联系临床，研究人群脑脊液的A和Tau蛋白的参考正常值，为AD的诊断提供客观的实验室依据。课研思路清晰，研究方法先进，论证可行，在国内属首