广西地方标准《甘蔗梢腐病的鉴定检测方法》（征求意见稿）.doc

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/ T XXXXXXXX甘蔗梢腐病的鉴定检测方法Methods for the identification and detection of Sugarcane Pokkah Boeng disease点击此处添加与国际标准一致性程度的标识2015 - XX - XX发布2015 - XX - XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/ T XXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业厅提出。本标准起草单位：亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、广西大学。本标准主要起草人：张木清、徐世强、王继华、魏晶晶、暴怡雪、覃丽芳。6甘蔗梢腐病的鉴定检测方法1 范围本标准规定了甘蔗梢腐病的鉴定技术及其致病菌的qPCR和常规PCR的检测方法。 本标准适用于甘蔗植株叶片、种苗及种茎中甘蔗梢腐病及其病原菌的快速诊断及检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件2.1甘蔗梢腐病 Sugarcane Pokkah Boeng disease甘蔗梢腐病是一种真菌性病害，病原菌无性阶段为半知菌亚门镰孢属串珠镰孢菌Fusarium moniliforme Sheldon，有性阶段为子囊菌亚门赤霉属藤仓赤霉菌Gibberella fujikuroi (Sawada)Wollenw，主要危害甘蔗梢部，严重时导致甘蔗梢部坏死。高温高湿天气有利于病害流行，病原菌分生孢子主要随气流传播。2.2Ct值 Cycle Threshold每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。2.3ITS Internal Transcribed Spacer在rDNA基因中，5.8S rDNA和 28S rDNA基因间隔序列称为（ITS），它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行 RFLP 或序列分析，可用于对真菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。3 缩略词下列缩略词适用于本文件： qPCR：Real-time Quantitative PCR Detecting System，实时荧光定量核酸扩增检测系统； PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应； DNA: Deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸； Taq 酶：Taq DNA 聚合酶； dNTPs：四种脱氧三磷酸核苷酸混合液； FAM：6-羧基荧光素。4 原理通过对中国大陆甘蔗各产区的甘蔗梢腐病菌进行形态学和分子生物学鉴定，结合ITS序列聚类分析，初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原为镰刀菌（Fusarium）的两个种，F.verticillioides gx1 (Fv) and F.proliferatum gx2 (Fp)，其中gx1 为优势种,主要发生在夏季，gx2主要发生在冬季。因此，根据gx1和gx2两个种的ITS序列易变异区设计特异引物和Taq Man探针，通过qPCR技术和常规PCR技术对甘蔗梢腐病的病原菌进行快速检测和准确鉴定。5 仪器和用具5.1 主要仪器高速冷冻离心机，PCR仪，荧光定量PCR仪、电泳装置、凝胶成像系统、酶标仪、恒温培养箱、高压灭菌锅、微量加样器、超净工作台、显微镜等。5.2 主要用具PCR管、培养皿、离心管、移液器吸头等。6 试剂和材料6.1 PDA培养基配方：马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 15 g/L，pH自然。6.2 PDW培养基配方：马铃薯 200 g/L,葡萄糖 20 g/L, pH自然。6.3 提取液：主要成分为十二烷基磺酸钠（SDS），为DNA提取试剂。6.4 酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)。6.5 无水乙醇。6.6 TE缓冲液:10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, PH=8.0。6.7 PCR及qPCR反应相关试剂。7 样品处理7.1 样品采集采样过程中应避免样本交叉污染，采样工具应用75%酒精消毒，采样过程中佩戴一次性手套。受到侵染并发病的叶片，经过拍照和编号后放入4冰箱保存备用，最多保存7 d。7.2 病原菌分离纯化取病斑与健康部分交界处的植株组织，剪成边长为0.5 cm大小的方块，在70%的酒精溶液中浸泡10 s，然后0.1%升汞中灭菌40 s，最后无菌水冲洗三次，置于灭菌滤纸上晾干，接于含氨苄青霉素100 g/ml的PDA培养基上，28 C倒置培养34 d。菌丝长出后，根据菌落形态的差异，挑取菌丝进行划线纯化培养。挑取萌发的单菌落菌丝体再次划线纯化培养，纯化三代，最后获得纯菌株。7.3 病原菌DNA提取将7.2得到的纯菌株接种于含氨苄青霉素100 g/ml的PDW培养基上，28 C，220 r/min震荡培养34 d。用甘油保存菌种于-80冰箱。剩余的菌液置于离心管中，4C，12000 rpm，离心10 min收集菌丝体。采用SDS法提取菌丝体的基因组DNA，具体方法如下：将离心收集得到的菌丝体置于研钵，加入液氮并研磨成粉末，转移到1.5 ml 离心管中，加入600 L的SDS提取液和等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液，剧烈涡旋5 min，4C，12000 rpm,离心5 min，将上清液转移至新的离心管中；加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒数次充分混匀，4 C，12000 rpm，离心5 min，将上清液至新的离心管中。重新抽提一次后（以便除去杂质，提高纯化效率），吸取上清液至新的离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，置于-20 C冰箱放置30min后，4 C，12000 rpm,离心10 min，去上清并用70%乙醇洗涤两次。将盛有DNA的离心管置于超净工作台吹15 min，加入50 L 的TE缓冲液并置于-20 冰箱保存。琼脂糖凝胶电泳判断所提各样品的DNA质量。7.4 病叶DNA提取采用7.3所述的SDS法提取发病叶片的DNA保存备用。8 鉴定技术8.1 鉴定方法8.1.1 症状特征鉴定调查田间自然发病的甘蔗，采集不同地点、不同部位、不同品种、不同季节感病的甘蔗，描述发病时的病症、病状，根据症状特征可以初步快速判定。8.1.2 病原特征鉴定将7.2得到的纯菌株接种在含氨苄青霉素100 g/ml的PDA培养基上,28 倒置培养34 d，观察菌落形态，并挑取菌落边缘菌丝制片观察并记录菌丝形态；培养78 d，用无菌水洗孢子，制片观察并记录孢子形态、测量大小。8.1.3 基于ITS序列的分子鉴定真菌鉴定通用的引物序列： ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR反应体系：10PCR Buffer(含Mg2+)2.5l，dNTPs（10mM each）0.5 l，Taq 酶0.15l，引物(10M)各1.0 l，40ng模板DNA，用ddH2O补足至25 l。PCR反应程序为：94C预变性4 min；94C变性40 S，54C退火35 S，72 C延伸45 S，35个循环；72 C延伸10 min，4 C保存。PCR结束后用1%的琼脂糖凝胶上电泳，目的条带经过回收纯化后连接至pMD18-T载体系统(TaKaRa公司，详细操作见说明书），委托上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果进行Blast分析，采用DNAMAN进行多重序列比对，用软件MEGA 6.0构建系统发育树进行分析。8.1.4 致病性测定将7.2获得的纯菌株接种在含氨苄青霉素100 g/ml的PDA平板上培养7-8 d，用无菌水冲洗孢子，并用4层纱布过滤去除菌丝，将孢子浓度调至106107cfu/ml用于接种。接种方式采用微量进液器进行注射接种，接种的甘蔗材料选择ROC22号，选取健康的蔗茎砍成单芽，种植在在温室中备用。长到34片叶时进行接种，将菌液注射至生长点，接种部位为+1叶叶环下面1 cm处，当看到新叶冒出菌液为止。每次处理10株，三次重复，用无菌水作为对照，7 d后观察症状。出现症状后，用7.2的方法进行病原菌的再分离、纯化。8.2 鉴定结果8.2.1 症状特征甘蔗梢腐病主要发生在甘蔗的梢部和幼嫩叶片，感病后引起腐烂，故名梢腐病。被害心叶呈梯形凹凸扭曲，并有纵裂，叶缘和叶尖有红或黑色的病斑，呈烧焦状态。受害严重时，生长点周围组织变软变褐，心叶坏死，形成梢腐，使整株甘蔗枯死。轻度发病的蔗梢心部叶片部分腐烂，大部分可以恢复生长，中度发病的蔗梢心叶完全腐烂，形成“死尾蔗”，重度发病的蔗梢变褐腐烂。8.2.2 病原特征试验结果表明，甘蔗梢腐病病原菌在含氨苄青霉素100 g/ml的PDA培养基上菌落背面呈淡黄色，菌丝无色，分枝不规则，有的菌丝组合成孢梗束，产生两种分生孢子：大型分生孢子和小型分生孢子，大型分生孢子镰刀状，具隔膜，小型分生孢子生于分生孢子梗顶端，呈现卵型，无隔膜。8.2.3 ITS序列鉴定将各甘蔗产区分离得到的103个菌株用真菌通用引物ITS1和ITS4进行扩增，测序所得片段长度485bp603 bp，将测序所得的序列经过Blast比对分析，发现亲缘关系与镰刀菌属F.verticillioides、F.proliferatum的亲缘关系较近，连同从GenBank下载镰刀菌属不同种的ITS序列一起用于系统发育分析。通过分析发现，第一类（gx1）包括93个菌株序列以及F.verticillioides NRRL22172 and F.sacchariNRRL13999的参考序列,第二类（gx2）包括7个菌株序列以及F.proliferatum and F.fujikuroi的参考序列。8.2.4 致病性特征注射接种7 d后出现甘蔗梢腐病症状，经过病原菌的在分离和纯化后的菌株与原菌株的病原特征一致，而对照没有出现症状。8.2.5 结果判定发病症状、病原特征、分子鉴定以及致病性特征与上述结果一致的，鉴定为甘蔗梢腐病。9 致病菌的快速检测方法9.1 特异引物常规PCR检测法此法检测要求：真菌DNA样品的检测浓度为10 ng/l至1000 ng/l，此法适合对病原菌分离纯化并提取的DNA进行检测。9.1.1 特异检测引物gx1的常规PCR引物：Pgx1-as1: CGATTACCAGTAACGAGGGTTTPgx1-r1: GGAGGGATCATTACCGAGTTTAC扩增片段大小为439bp。gx2的常规PCR引物：Pgx2-as2: CGAGACCGCCACTAGATTTCPgx2-r2: GGAGGGATCATTACCGAGTTTAC扩增片段大小为400bp。9.1.2 常规PCR反应操作技术常规PCR检测分别以特异引物Pgx1-as1/Pgx1-r1和Pgx2-as2/Pgx2-r1扩增反应，每个测试样本PCR体系为：Taq酶(5U/l) 0.15l，10x PCR buffer 2.5l，MgCl2(25mM) 1.0l,引物(10M)1.0 l,dNTPs(10mM each) 0.4l，模板DNA（7.2提取）1l，最后用ddH2O补足至25l。PCR反应程序：944 min；94 15 s，63 15 s，72 30s，33个循环；72 10 min；4 保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据标准的DNA分子量估计扩增条带的大小进行分析。9.1.3 对照结果检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含甘蔗梢腐病的样品或梢腐病菌DNA作阳性对照；用已知不含甘蔗梢腐病的样品作阴性对照；以等体积ddH2O代替模板DNA作空白对照。空白对照：无目标扩增条带。阴性对照：无目标扩增条带。阳性对照：出现目标扩增条带。9.1.4 结果判定如果阳性对照和检测样品中同时出现目的的扩增条带，而阴性对照和空白对照均不出现该目的条带，该样品判断为阳性，并根据所用的引物判定小种类型；如果阳性对照出现目的扩增条带，而阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判断为阴性；如果空白、阴性对照出现该目的条带，或阳性对照未出现目的条带，应该重新检测。9.2 TaqMan荧光定量PCR检测技术此法检测要求：真菌的DNA浓度介于1 ng/l至1000 ng/l是TaqMan探针检测的最佳浓度，此法适合对病原菌分离纯化并提取的DNA以及对病叶组织提取的DNA进行检测。9.2.1 qPCR引物和探针gx1的qRT-PCR引物和探针：FAM-gx1-AS4: CTGTTCGAGCGTCATTTCAACFAM-gx1-P4: CGCGAGTCCCAACACCAAGCFAM-gx1-R4：GACGATTACCAGTAACGAGGGgx2的qRT-PCR引物和探针：FAM-gx2-AS6：TCATTTCAACCCTCAAGCCCFAM-gx2-P6：CGCCGATCCCCAACACCAAACFAM-gx2-R6：GAGACCGCCACTAGATTTCG9.2.2 qPCR反应操作技术每个测试样本qPCR体系为：总体积为20 L，其中上下游探针引物(FAM-gx1-AS4/FAM-gx1-R4 或 FAM-gx2-AS6/FAM-gx2-R6)500 nM，探针(FAM-gx1-P4或FAM-gx2-P6) 250 nM，Premix LA Taq 10 L，模板DNA（7.2或7.3提取）1 L，用ddH2O补足，置于Roche 480荧光定量PCR系统运行分析，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，荧光模式设为FA