广西地方标准《H10N8亚型禽流感病毒检测多重反转录聚合酶链（RT-PCR）检测法》（征求意见稿）编制说明.doc

广西地方标准H10N8亚型禽流感病毒检测 多重反转录聚合酶链（RT-PCR）检测法（征求意见稿）编制说明一、项目目的意义（项目背景）、项目来源、工作概况1、项目背景H10N8亚型禽流感病毒属于A型禽流感病毒（AIV），感染禽类可以引起禽的呼吸道症状和产蛋鸡产蛋下降，严重可引起家禽死亡，给养禽业带来严重的经济损失。H10N8亚型禽流感病毒不但感染禽，还可以感染人，引起人的死亡。2013年12月6日，江西省南昌市一名73岁女子罹患H10N8亚型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，这是全球首次发现的H10N8亚型高致病性禽流感病毒感染人并致人死亡案例，2014年1月25日，南昌又确诊一例H10N8亚型禽流感。我国是养禽大国，H10N8亚型禽流感病毒对禽类危害极大，可以引起大批禽类死亡，导致严重的经济损失，同时，H10N8亚型禽流感病毒也可以感染人，引起人死亡，因此，世界各国都非常重视H10N8亚型禽流感病毒的防控，尤其是在禽类中防控H10N8亚型禽流感病毒，防止从禽类传到人。目前国内外检测禽流感的方法是病毒分离鉴定和RT-PCR核酸检测法，病毒分离鉴定方法费时费力，对人危害大，对快速检测诊断有局限性。而针对病毒建立的RT-PCR检测方法，主要是检测病原核酸， RT-PCR是目前检测该病毒病原最常用的方法，操作简单，省时省力，结果当天即可判断，已经成为目前疫病诊断的首选技术。国内已建立有检测鉴别H5亚型禽流感病毒的标准，但是还没有多重反转录聚合酶链反应检测鉴别H10亚型和N8亚型禽流感病毒的技术标准。2. 项目来源本标准为自治区质量技术监督局下达2015年第二批广西地方标准制定（修订）项目计划（桂质监函2015183号），由广西壮族自治区兽医研究所承担。广西兽医所内“H10N8亚型禽流感病毒检测 多重反转录聚合酶链（RT-PCR）检测法”编写小组，按中华人民共和国国家标准GB/T1.1 2009标准化工作导则第1部分“标准的结构和编写规则”的要求组织编写的。计划于2015年完成。3. 工作概况本标准起草团队承担广西科技重大专项“不同亚型禽流感病毒新型高通量快速检测技术研究与应用”（编号：桂科重14121003-4-2），先后建立了不同亚型禽流感病毒环介导等温扩增技术、实时荧光RT-PCR、多重RT-PCR、二温式RT-PCR和半巢式RT-PCR快速诊断技术，并发表相关论文30多篇。上述技术支持确保能完成本标准起草制定任务。本标准起草团队从2014年初开始收集整理地标制订工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制（修）订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2015年3月接到自治区质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准起草工作小组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。编制小组根据任务分工进行了资料收集和调查研究工作。一方面，采集活禽市场的家禽和野鸟的棉拭子样品，对其进行分离与鉴定，掌握广西不同亚型禽流感病毒的流行情况。二是查阅相关聚合酶链式反应法的技术要领，分析H10亚型的HA基因和N8亚型NA基因的保守序列，并设计引物，上网比对，制定H10N8亚型禽流感病毒多重RT-PCR标准操作规程。由广西壮族自治区兽医研究所组织编写，并于2015年10月完成了标准征求意见稿的起草工作。本标准起草人员：谢芝勋、罗思思、谢志勤、谢丽基、邓显文、刘加波、范晴、黄莉、黄娇玲、曾婷婷、王盛、张艳芳。二、标准编制原则1. 政策性原则本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。2. 先进性原则以国内外相关文献资料为参考，力求反映该领域最新的科技成果。以国内同类标准制订编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3. 经济性原则在本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室及临床验证到形成征求意见稿的逐一环节，在确保质量的前提下均力行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写工作。4. 适用性原则本标准集国内外PCR检测技术的成功经验，并经实验室与临床应用验证，且完全按照国家标准的要求编写，内容全面，形式规范，可操作和实用性强。5. 协调统一性原则本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准的协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家标准、行业标准和地方标准重复或相矛盾。6. 规范化原则本标准是严格按照GB/T 1.1-2000的要求来编写的。三、标准主要主要技术内容及依据 本标准的主要依据是参考有关文献资料，结合我区区情，通过实验室研究试验及临床验证后，并参考其他资料经室内、室间验证提出。本标准根据广西壮族自治区兽医研究所对禽流感病毒病原学与检测技术研究的成果，针对H10亚型HA基因和N8亚型NA基因，分别设计了两对特异性引物，优化建立可以快速检测H10N8亚型AIV的多重H10N8亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链检测方法，用RT-PCR，并对其特异性和敏感性进行了测定，并用临床样品对其可行性进行评估。结果表明，该多重RT-PCR可检测出成功地检测出H10N8亚型AIV，而对其它禽病病原的检测结果为阴性；其最低可检测出1pg的H10N8亚型AIV RNA。四、与现行法律、法规和有关标准的关系 从事H10N8亚型AIV的检测实验，必须遵守动物疫病实验室检验采样方法（NY/T541-2002）、病原微生物实验室生物安全管理条例（中华人民共和国国务院令第424号）、兽医实验室生物安全管理规范（农业部302号公告）等相关法律、法规和强制性标准。对于H10N8亚型AIV的检测和诊断，目前尚无明确的国家标准及相关行业及地方标准。PCR方法快速、准确、敏感、操作较简便，易标准化，能准确快速检测和诊断H10N8亚型AIV。目前多数基层单位均装备有PCR仪及相关设备，所以易于在基层推广应用。综上所述，本标准提供的多重RT-PCR检测方法不仅与目前现行法律、法规和有关标准没有冲突，而且是对现行行业标准和防治技术规范的有益补充。五、采用国际标准或国外先进标准的情况 本标准为国内首创，未采用国际标准或国外先进标准。六、地方标准作为强制性地方标准或推荐性地方标准的建议本项标准的制订，试验数据充分、可靠，经过实验室和临床实践的考验，可作为推荐性地方标准，适用于H10N8亚型禽流感病毒的检测。七、本规程的一些有关说明本规程在“5.2 样品的准备”中给出了2种不同材料的准备方法。其中：5.2.1.1和5.2.1.2给出了从临床样品直接取样进行病原核酸抽提的材料准备方法；5.2.2给出了从病原分离培养物中取样进行病原核酸抽提的材料准备方法。在操作时可根据具体情况选择其中一种或多种方法进行。因本技术直接针对病原基因进行检测，敏感性非常高，所以在操作过程中要特别注意，避免样品之间交叉污染而出现的假阳性结果。另外，RNA酶在环境中无处不在，抽提好的待检R