广西地方标准《猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测多重反转录聚合酶链反应法》（征求意见稿）编制说明.doc

广西地方标准PRRSV美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测 多重RT-PCR法（征求意见稿）编制说明一、项目背景、来源及目的1、项目背景猪蓝耳病，又名猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是猪的一种高度接触性传染病。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起，能够感染不同品种、性别和年龄的猪，患病母猪主要临床表现为繁殖障碍，表现为流产、产死胎、木乃伊胎及弱仔，而患病仔猪和育成猪则主要出现呼吸系统症状，该病还能引起患病猪的免疫抑制。该病最早于1987年在美国发生，现已呈世界性分布。我国于1996 年首次分离到PRRSV美洲型经典毒株，2006 年分离到PRRSV美洲型高致病性变异毒株（HP-PRRSV），2010 年分离并鉴定了致病性PRRSV欧洲型毒株。目前在中国流行的 PRRSV以美洲型毒株为主，但也存在欧洲型毒株。PRRSV 流行毒株在临床上的多样性给疫病的快速诊断和防控带来很大困难。 PRRSV属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小约15 kb，包含9个开放阅读框。该病毒分为两个基因型，即以VR-2332株为代表的美洲型和以Lelystad Virus（LV）株为代表的欧洲型，两种基因型核苷酸序列同源性仅为60 %左右。目前已建立了检测多种 PRRSV 病原的方法，RT-PCR 是其中特异、敏感、快速的常用检测方法。但应用多重 RT-PCR 法同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和欧洲型毒株的方法尚未归纳、总结形成国家、农业行业或地方标准。2014年以来，我单位在完成广西农业科技成果转化项目高致病性猪蓝耳病快速诊断及免疫防控技术应用示范（编号：桂科转14125004-22，主持人：施开创）的过程中，根据我区重大动物疫病监测、检测的需要，针对 PRRSV 病毒的基因序列设计了 3 对特异性引物，建立了同时检测美洲型及欧洲型 PRRSV 的多重 RT-PCR 检测方法， 并应用于临床检测。该方法经实验室验证及临床反复应用，证明具有快速、准确、特异、敏感、无污染等优点，可以用于临床样品的检测，为临床快速检测以及流行病学研究提供了有效的技术平台。2、项目来源本地方标准为自治区质量技术监督局下达给广西壮族自治区动物疫病预防控制中心承担的2015年第二批广西地方标准制定（修订）计划项目（桂质监函 2015 183号），编号2015-0257。3、项目目的目前用于检测PRRSV 的方法主要有病毒分离、免疫过氧化物酶单层细胞试验( IPMA) 、免疫荧光试验( IFA) 、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等。但能够同时检测和区分PRRSV 美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的多重RT-PCR迄今尚无国家、农业行业或地方标准，因此，制定一个同时检测并区分这三种毒株的地方标准十分必要。本项目制定了检测PRRSV 美洲型经典株、美洲型变异株以及欧洲型毒株的多重RT-PCR的推荐性地方标准，内容涵盖应用多重RT-PCR检测这三种毒株的材料准备、操作方法及结果判定等。二、工作概况从2014年1月开始，我单位承担了广西农业科技成果转化项目高致病性猪蓝耳病快速诊断及免疫防控技术应用示范。课题组在PRRSV的快速鉴别诊断方法上开展了大量研究工作，取得较好成果。鉴于国内没有检测PRRSV美洲型经典株、美洲型变异株以及欧洲型毒株的多重RT-PCR的国家、农业行业及地方标准，课题组开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制订广西地方标准项目建议书，积极开展标准的申报。2015年5月接到自治区质量技术监督局下达的地方标准制定（修订）项目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。至2015年7月31日已完成标准初稿的编写。本标准编制课题组人员包括：施开创、蒙振亩、张步娴、莫胜兰、王海清、尹彦文、韦建华、胡 杰、李 军。具体分工如下：施开创：主持人，全面负责标准起草、修改、审定。蒙振亩：负责实验室试验及临床验证。张步娴：负责比对试验。莫胜兰：负责实验室试验及临床验证。王海清：负责盲样检测。尹彦文：负责比对试验。韦建华：负责临床验证。胡 杰：负责标准的起草、校正、外联。李 军：负责标准稿审核。三、标准编制原则1、政策性原则：本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。2、先进性原则：以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技成果；以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3、经济性原则：本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室和临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力行节约，利用有限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原则：本标准集国内外PRRSV RT-PCR检测技术的成功经验，并经实验室和临床验证，完全按照要求编写，内容全面，形式规范，可操作性和实用性强。5、协调统一性原则：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与已有的国家、农业行业和地方标准相重复或矛盾。6、规范化原则：本标准是严格按照国家标准GB/T 1.1-2009的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控推荐性地方标准，编写重点是疫病的检测。标准的主要依据是借鉴国内先进标准和技术内容，参考国内外有关文献资料，结合我国国情，进行实践研究，并通过实验室和临床验证后提出。标准编写主要内容包括样品采集、处理、多重 RT-PCR 操作过程以及结果的判定，适用于 PRRSV 的检测。标准的建立过程主要进行了以下试验：1、试剂和材料（1）主要试剂Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0（包含 RNA 抽提所需的全部试剂）；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0（包含了 RT-PCR 扩增所需全部成份）。（2）设备普通 PCR 仪；核酸蛋白分析仪。（3）参考毒株和引物序列分别见表1和表2表1 试验用毒株、质粒及其来源毒株或质粒名称来源PRRSV 美洲型经典株(VR-2332)广西壮族自治区动物疫病预防控制中心美洲型JXA1-R 株(疫苗毒)广东大华农动物保健品股份有限公司p-EU-ORF7（欧洲株ORF7阳性质粒）北京畜牧兽医研究所兽医研究室惠赠p-AM-ORF7 （美洲株 ORF7 阳性质粒）广西壮族自治区动物疫病预防控制中心p-Nsp2-VR2332（VR2332 株 Nsp2 阳性质粒）广西壮族自治区动物疫病预防控制中心p-Nsp2-JXA1（JXA1 株 Nsp2 阳性质粒）广西壮族自治区动物疫病预防控制中心表2 引物序列及扩增长度引物名称引物序列（53）针对毒株长度（bp）CO-ORF7-FATGGCCAGCCAGTCAATCA美洲型/欧洲型433/398CO-ORF7-RTCGCCCTAATTGAATAGGTGAM-Nsp2-FGGCGGCAATGTCCCTAAC美洲型经典株/美洲型变异株338/248AM-Nsp2-RGCCTCATATTCAGTCTGTGEU-ORF5-F EU-ORF5-RCTGCAATGAGGTGGGCTACAACTAACCCCTTCGAGGACG ACAT 欧洲型毒株614注：CO-ORF7-F和CO-ORF7-R引物对扩增美洲型毒株时长度为433 bp，扩增欧洲型毒株时长度为398 bp。 AM-Nsp2-F和AM-Nsp2-R引物对扩增美洲型经典株时长度为338 bp, 扩增美洲型变异株时长度为248 bp。EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物对扩增欧洲型毒株的长度为614 bp。（4）样品来源广西动物疫病预防控制中心 2013 年至 2015 年从广西各地采集的203份疑似 PRRS 病猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织。2、方法（1）待检样品的处理无菌采取病猪肺脏、脾脏和淋巴结等共约1 g，置于2.0 mL离心管中，加入灭菌的1 mol/L PBS（pH 7.2）1mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融3次；细胞培养物则直接反复冻融3次。以10 000 g离心5 min，收集上清，用于总RNA抽提，或置 -20 保存备用。血清样品可直接用于总RNA抽提，或置 -20 保存备用。（2）待检样品总RNA提取取待检样品上清200 L置于无 RNA酶的1.5 mL离心管中，加入 200 L Buffer VGB，20 L的 Proteinase K，1.0 L的Carrier RNA，充分混匀，置56水浴锅温浴10 min；向上述裂解液中加入200 L无水乙醇，充分吸打混匀。将Spin column安置于Colletion Tube上，溶液移至Spin column中（套在2.0 mL收集管上），12 000 rpm离心2 min，弃滤液；将 500 L的Buffer RWA加入到Spin column中；12 000 rpm离心1 min，弃滤液；将 800 L的Buffer RWB加入到Spin column中；12 000 rpm离心1 min，弃滤液；12 000 rpm离心Spin column 2 min；将Spin column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin column膜的中央处加入 50 L的RNase free dH2O，室温静置5 min；12 000 rpm离心2 min，洗脱病毒RNA。（3）反转录在冰浴条件下，在 PCR反应管中按下表用量分别加入各成分：试剂名称用量终浓度10 RT Buffer1 L1 倍dNTP Mixture（10 mM each）1 L1 mmol/LRnase Inhibitor（40 U/L）0.25 L1 U/LAMV Reverse Transtriptase (5 U/L)0.5 L0.25 U/LMgcl2（25 mM ）2 L5 mmol/LRandom 9 mers (50 pmol/L)0.5L2.5 pmol/L待检总RNA模板2 L加灭菌双蒸水至总体积为10 L加完试剂后瞬时离心混匀，将PCR反应管置于PCR仪内，按以下循环条件进行RT反应： 30，10 min；42 ，30 min； 95，5 min。（4）多重PCR的建立在冰浴条件下，在PCR 反应管中按下表用量分别加入各成分：试剂名称用量终浓度5 PCR Buffer（含dNTP Mixture、Mg2+）10 L1 倍Ex Taq HS聚合酶0.25 L0.025 U/LEU-ORF5-F（25 pmol/L）1 L0.5 pmol/LEU-ORF5-R（25 pmol/L）1 L0.5 pmol/LCO-ORF7-F（25 pmol/L）0.5 L0.25 pmol/LCO-ORF7-R（25 pmol/L）0.5 L0.25 pmol/LAM-Nsp2-F（25 pmol/L）1 L1 pmol/L/AM-Nsp2-R（25 pmol/L）1 L0.5 pmol/L模板5 L加灭菌双蒸水至总体积为50 L加完试剂后瞬时离心混匀，将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，按如下程序进行反应：预变性 94 3 min；94 30 s，56.230 s ，72 45 s 共35个循环；最后72 10 min。（5）多重PCR的特异性试验分别用该方法对猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等临床阳性病料提取RNA并反转录后获得的cDNA或DNA为模板，应用建立的多重PCR 进行扩增，以检验该方法的特异性。（6）多重PCR的敏感性试验将已知浓度的p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1 等 4 种阳性重组质粒按等浓度混合后进行 10 倍系列稀释，使其浓度梯度为 1010101 copy/L。取 5 L为模板进行 PCR，根据其能检测的最大稀释度判定多重 PCR 的最小检出量。（7）多重 PCR 的重复性试验将已知浓度的p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1 等 4 种阳性重组质粒按等浓度混合后进行 10 倍系列稀释，选取各种质粒浓度均为106拷贝/ L的混合物作为模板，在优化反应条件下进行多重PCR，重复5 次反应，分析其重复性。（8）多重RT-PCR法对临床样品的检测临床病料来自 2013 年2015 年广西各地发病死亡的疑似病猪，共 203份。取脾、肺、淋巴结共约 1 g，置于 2.0 mL 离心管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融 3 次，以 10 000 g 离心 3 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，应用所建立的多重 RT-PCR进行 PRRSV 检测。同时，按照国家标准猪繁殖与呼吸综合征诊断方法(GB/T 18090-2008)中规定的单重 RT-PCR 方法对上述临床疑似病料进行检测，以验证所建立的检测方法与国家标准检测方法的符合率。3、结果（1）多重PCR法的检测结果 将已知浓度的p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1 等 4 种阳性重组质粒按等浓度混合物作为模板，以及p-EU-ORF7、美洲型经典株 VR-2332 的 cDNA、美洲型变异株JXA1株 cDNA 分别作为模板，经过反应条件的优化，成功建立了检测 PRRSV 的多重 PCR 检测方法。结果见图1。（2）多重 PCR 法的特异性试验结果以浓度均为106拷贝/ L的4 种阳性质粒混合物和 CSFV、FMDV 、 PCV2、PRV、PPV、BVDV的cDNA/DNA作为模板，进行多重 PCR。结果只有重组质粒反应呈阳性，而 CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PPV、BVDV 均为阴性，没有交叉反应（图 2）。图1 PRRSV多重反转录聚合酶链反应图M. 100 bp 分子质量标准; 1. 重组质粒混合物；2. p-EU-ORF567；3 .美洲型经典株cDNA.；4. 美洲型变异株cDNA；5.阴性对照图2 多重PCR的特异性试验M. 100 bp 分子质量标准; 1. 混合重组质粒; 2. FMDV; 3. CSFV; 4. PCV2; 5. PRV; 6. PPV、7. BVDV; 8. 阴性对照（3）多重PCR 法的敏感性试验敏感性试验分别以10 倍系列稀释的 4 种质粒为模板进行单重 PCR。结果显示，CO-ORF7引物对以p-AM-ORF7 和 p-EU-ORF7质粒为模板的检出下限均为1.0102拷贝/L；AM-Nsp2引物对以p-Nsp2-VR2332 和p-Nsp2-JXA1 质粒为模板的检出下限均为 1.0102拷贝/L；EU-ORF5引物对以 pMD-EU-ORF7 质粒为模板的检出下限为1.67103拷贝/L。而将10 倍系列稀释的 4种重组质粒等体积混合后作为模板进行多重PCR，结果显示，3 对引物的检出下限均为 1.0103 拷贝/L（图3）。 M: 100 bp分子质量标准; 1-9: 1.671091.67101 拷贝/L; 10: 阴性对照图3 多重PCR 的敏感性试验（4）多重PCR法的重复性试验以p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-Nsp2-VR2332、p-Nsp2-JXA1 等 4 种阳性重组质粒的浓度均为1.0106 拷贝/L的混合物作为模板，在优化反应条件下进行多重 PCR。结果显示，5 次重复试验均能够扩增出均匀一致的目的片段，具有很好的重复性。（5）多重 PCR 法对临床样品的检测 应用所建立的多重 RT-PCR 方法对 203