实验--MS培养基母液和常用试剂的配制.ppt

实验1 胡萝卜愈伤组织的诱导培养 实验内容： 1-1 MS培养基母液和常用试剂的配制 1-2 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制 1-3 胡萝卜愈伤组织的诱导 1-4 胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制 1-5 胡萝卜愈伤组织的继代培养 实验1-1 MS培养基母液 和常用试剂的配制 1 实验目的 通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS 培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩 固相关理论基础知识。 2 实验原理 培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生 存的营养基质。配制培养基时，为了减少 试剂称取时的工作量和少量称取时出现的 误差，以及避免多种营养成分混合导致沉 淀产生或相互反应而失去培养效果，预先 要将各种营养成分配制为一定倍数的培养 基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母 液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50 倍、100倍等或更高。 3 主要实验用具和仪器 冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的 试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、 烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、 玻棒、标签纸、pH试纸（pH5.47.0）， 电磁炉等。 4 药品和试剂 硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸 二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸 钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠 、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸 吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧 乙酸)、NAA（-萘乙酸）、 6-BA （ 6- 苄基腺嘌呤）、 KT、浓盐酸、氢氧化钠、 浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水等 。 5 MS培养基母液和 常用试剂的配制流程 5.1培养基的成分 目前，不论液体培养还是固体培养，大多 数植物组织培养中所用的培养基都是由无 机营养物、碳源、维生素、生长调节物质 和有机附加物等几大类物质组成。 5.2 培养基的配制方法 配制培养基的最简单的方法是用市售培养 基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂 和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之 达到最终的容积。最后调节pH值，高压灭 菌，于是制成所需要的培养基。 如果没有培养基干粉，则可采用以下两种 方法来配制： 一个是按照配方规定的数量分别称量出各 种成分，分别使它们溶解于水，然后再将 它们混合在一起。 另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母 液），贮存在24冰箱内，待配培养基 时取出，按比例稀释配用。此法较为常用 。 5.3 MS 培养基母液的配制 母液的配制有两种方法： 一种是配制成单一化合物母液。此法适合 配制多种培养基都需要的同一种母液。 另一种是配成几种不同化合物的混合母液 。此法在大量配制同种培养基时省时省力 。由于MS 培养基较为常用，故配制MS 培 养基母液。 配好的母液应放在试剂瓶中贮存。 在配制MS培养基母液时，为减少工作量可 以把几种药品（如培养基中的大量元素或 微量元素）配在同一母液中，但应注意各 种化合物的组合以及加入的先后顺序，以 免发生沉淀。 通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已 完全溶解的药品混合，或者待前一种化合 物完全溶解后再加入后一种化合物。混合 已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序 ，力求把Ca2+与SO42- 和PO43-错开，以免 形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，要 慢慢地混合，边混合边搅拌。 5.3.1 大量元素母液的配制 MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外 ，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、 CaCl2 2H20、MgSO4 7H2O、KH2PO4 几种无机盐来供应，它们可配在同一母液 中（具体配制见下表）。配制的步骤为： 确定母液的浓度和体积计算各种化合物 用量称量分别溶解混合定容装 瓶贴标签放入冰箱保存。 注意： CaCl2 2H2O最后加入 母 液 种 类 成 分 规定 用量 /mg L-1 浓 缩 倍 数 称取量 /mg 母液 定容 体积 /ml 配1L MS培养 基吸取 取量 /ml 大 量 元 素 KNO31900 20 38000 1000 50 NH4NO3165033000 CaCl2 2H204408800 MgSO4 7H2O3707400 KH2PO4 170 3400 5.3.2 微量元素母液的配制 MS培养基中的微量元素可由MnSO4 4H2O、ZnSO4 7H2O、H3BO3、KI、 Na2MoO4 2H2O、CuSO4 5H2O、CoCl2 6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在 同一母液中（具体配制见下表）。配制步 骤同大量元素（混合时不要求先后顺序） 。 母 液 种 类 成 分 规定 用量 /mg L-1 浓 缩 倍 数 称取 量/mg 母液 定容 体积 /ml 配1L 培养 基吸 取量 /ml 微 量 元 素 MnSO4 H2O16.9 200 3380 10005 ZnSO4 7H2O8.61720 H3BO36.21240 KI0.83166 Na2MoO4 2H2O0.2550 CuSO4 5H2O0.0255 CoCl2 6H2O 0.0255 5.3.3 有机成分母液的配制 MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机 成分母液应分别单独配制（具体配制见下 表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和 体积计算各种化合物用量称量溶解 定容装瓶贴标签放入冰箱保存。 亦可配制成混合母液（不主张采用）。 母 液 种 类 成 分 规定 用量 /mg L-1 浓 缩 倍 数 称 取 量 /mg 母液 定容 体积 /ml 配1L MS培 养基 吸取 量/ml 有 机 成 分 甘氨酸2.0 200 100 2505 盐酸硫胺素0.15 盐酸吡哆素0.525 烟酸0.525 肌醇1005000 5.3.4 铁盐母液的配制 铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为： 确定母液的浓度和体积计算各种化合物 用量称量分别溶解混合煮沸数分 钟调节pH值至5.8 定容装瓶（棕色 ）贴标签放入冰箱保存。 用时每配l L培养基取该溶液5ml。 母 液 种 类 成 分 规定 用量 /mg L-1 浓 缩 倍 数 称 取 量 /mg 母液 定容 体积 /ml 配1L MS培 养基 吸取 量 /ml 铁 盐 Na2EDTA 2H2O37.3 200 3730 5005 FeSO4 7H2O27.82780 5.3.5 植物生长调节物质母液的配制 对于植物生长调节物质，配制成母液时， 通常用mgml-1或 ppm 较为方便，一般配 制成0.1-1mgml-1的母液，这样的浓度便 于计算也可避免冷藏时形成结晶。 2,4-D/NAA用少量95酒精溶解，再加水定 容；6-BA/KT应先溶于少量1 molL-1的HCl 中，再加水定容。 具体配制见下表： 母液 种类类 成 分 称取量 (mg ) 母液定 容体积积 (ml ) 母液浓浓 度 (mg/ml) 生长长素 2,4-D501000.5 NAA501000.5 细细胞分 裂素 6-BA101000.1 KT101000.1 5.3.6 其它常用试剂的配制 盐酸（lmolL-1 ）：用浓度36.5%、密度 1.19g/cm3的浓盐酸配制 氢氧化钠（lmolL-1 ）：用固体氢氧化钠配 制 75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制 稀铬酸洗涤液：重铬酸钾50 g溶于1000 ml 蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90 ml。 配制好的各种母液应分别贴上标签，写明 母液名称、配制倍数、配制者、配制日期 。 母液最好在24的冰箱中保存。尤其对 生长调节物质与有机类物质要求较严。 贮存时间不宜过长，如发现有