水稻同源异型域转录因子OsHox9的反向遗传学分析.doc

水稻同源异型域转录因子OsHox的反向遗传学分析艾丽萍申奥高志超李政龙孙琼琳栾维江(天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室,天津;通讯联系人,Email:lwjzsqcom)ReverseGeneticsAnalysisoftheTranscriptionFactorOsHox,aMemberofHomeoboxFamily,inRiceAILiping,SHENAo,GAOZhichao,LIZhenglong,SUNQionglin,LUANWeijiang(CollegeofLifeScience,TianjinNormalUniversity/TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantResistance,Tianjin,China;Correspondingauthor,Email:lwjzsqcom)AILiping,SHENAo,GAOZhichao,etalReversegeneticsanalysisofthetranscriptionfactorOsHox,amemberofhomeoboxfamily,inriceChinJRiceSci,():Abstract:Thehomeoboxtranscriptionfactorsplayimportantrolesinthegrowthanddevelopmentoftheplants,involvedinregulationofcelldifferentiation,thearchitectureofmorphogenesisandresponsetoenvironmentalsignalsinplantsTostudythefunctionofthesetranscriptionfactorsinrice,weconstructedRNAivectorsofOsHoxandanalyzedthefunctionofOsHoxbythereversegeneticsmethodTheresultsshowedthattheheightandtillernumberofRNAitransgenicplantsweredecreasedincomparisonwithwildtypeplantsRealtimePCRanalysisshowedthatOsHoxexpressionlevelwasdownregulatedintransgenicplantswithphenotypeHowever,theexpressionlevelofOsHoxintransgenicplantswithoutphenotypewassimilartowildtypeplants,suggestingthatthephenotypesoftransgenicplantswerecausedbyRNAieffectsInaddition,wealsoanalyzedtheexpressionpatternofOsHoxindifferentorgansofriceTheresultsshowedthatOsHoxwasexpressedindifferentorgans,especiallydisplayedhighexpressionlevelinstemapicalmeristemsandyoungpaniclesToinvestigatethesubcellularlocalizationofOsHox,weconstructedthefusedvectorS:OsHoxGFPtointroduceintoleavesoftobaccoThetransientexpressionresultshowedOsHoxwaslocalizedonthecellmembraneKeywords:rice;OsHox;RNAi;expressionanalysis艾丽萍,申奥,高志超,等水稻同源异型域转录因子OsHox的反向遗传学分析中国水稻科学,():摘要:同源异型域(Homeobox,HB)转录因子对于植物的生长发育具有重要的调控作用,主要涉及细胞分化、形态建成、内外环境信号应答等多个方面.为了研究该转录因子家族成员在水稻中的功能,构建了该家族成员OsHox基因的RNAi表达载体,利用反向遗传方法分析该基因的功能.与野生型对照植株相比,RNAi转基因植株株高变矮,分蘖数减少.实时PCR表达分析表明OsHox基因在有表型转基因植株中的表达下调,但在没有表型转基因植株中OsHox表达量与野生型植株差异不显著,说明RNAi载体起到了干涉作用,转基因植株的表型是由RNAi造成的.组织特异性表达分析表明OsHox在水稻的根、茎、叶、茎顶端分生组织及不同时期的幼穗中均有表达,但在茎顶端分生组织及幼穗中表达量较高.为了查明OsHox的亚细胞定位,构建了OsHox与绿色荧光蛋白GFP的融合载体并导入烟草叶片中进行瞬时表达,结果表明OsHox定位于细胞膜上,在细胞膜上起作用.关键词:水稻;OsHox;RNA干涉;表达分析中图分类号:Q;S文献标识码:A文章编号:()同源异型域(Homeobox,HB)转录因子在动植物生长发育中起重要的作用.该转录因子包含一个高度保守的同源异型域(Homeodomain,HD),该结构域由个保守的氨基酸组成.根据HD基序序列、位置、两侧序列同源性的差异以及HB中其他保守结构域的不同一般可将植物HB转录因子家族分为亮氨酸拉链同源异型域转录因子(Homeodomainleucinezipper,HDZip)、Knotted相关同源异型域转录因子(knottedlikehomeobox,KNOX)、植物指形同源异型域转录因子(plant收稿日期:;修改稿收到日期:.基金项目:国家自然科学基金资助项目();天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目(JCZDJC);天津市高校中青年骨干创新人才培养计划资助项目().中国水稻科学(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissnhomeodomainfinger,PHDFinger)、Bell同源异型域转录因子(bellhomeodomain,Bell)、Wuschel相关同源异型域转录因子(Wuschelrelatedhomeobox,WOX)和锌指同源异型域转录因子(zincfingerhomeodomain,ZFHD)六大类.其中,HDZip是近年来高等植物中发现的一类特有的转录因子,它们在植物的各个组织器官中均有表达.HDZip转录因子中,HD和LZ结构域的空间排列在真菌和动物中均没有发现,由此可见,HDZip在高等植物特有的发育过程中起着特殊的作用.HDZip按编码蛋白基因结构、基序、识别结合特异性DNA序列及生理功能的差异,可以分为四个亚家族(HDZip、HDZip、HDZip、HDZip),其中,HDZip与、亚类存在很大的基因结构差异,通常识别的DNA序列为GTAAT(G/C)ATTAC.HDZip在植物顶端分生组织的分化、生长素的极性运输、维管组织的形成、近轴区域侧部器官以及胚胎发育等过程中起重要调控作用,.拟南芥中HDZip亚家族有个成员,分别为ATHB、REV、CAN、PHB、PHV,这些成员在拟南芥发育进程中功能有所冗余,起着部分重叠或拮抗的功能.水稻中HDZip亚家族有OsHox、OsHox、OsHox、OsHox、OsHox五个成员,目前这些成员的功能仍不明确.本研究通过反向遗传学方法对该家族中OsHox成员的功能进行探索,并分析了其表达模式及具体作用部位,结果表明该基因在水稻生长发育过程中起重要作用.材料与方法材料本研究所用的野生型及相关转基因植株的遗传背景都为粳稻品种中花(OryzasativaLsspjaponicacvZhonghua),材料种植于天津市农业科学院试验田,常规管理.总RNA的提取与cDNA的合成总RNA用TRIzol(Invitrogen公司)试剂提取,用DNase(NEB公司)消化基因组DNA.g处理后的RNA用MMLV反转录酶(TaKaRa)反转录成cDNA.载体构建RNAi载体的两段干涉特异片段从d大小水稻幼苗cDNA中PCR扩增获得,正向片段由引物IHoxF,CGTCggatccAATGATGATGGTTGGTCTG;IHoxR,TCGCggtaccCATCTATTCCAGTGCAAAGC获得,反向片段由引物IHoxF:CGTCgagctcCAATGATGATGGTTGGTCTG;IHoxR,CGGCactagtCATCTATTCCAGTGCAAAGC(小写字母为酶切位点)获得.PCR条件如下:下min;下s,下s,下s,运行个循环后下min.扩增的两段干涉特异片段分别连入RNAi空载体pCAMBIA中,酶切检测和测序正确后电击转入农杆菌EHA中,用农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻中花中.转基因植株的分子检测转基因植株叶片DNA的提取参考卢扬江等方法,略有改动.提取DNA作模板用潮霉素特异引物进行PCR扩增,引物序列分别为HygF,CTTCTGCGGGCGATTTGT;HygR,CAGCGTCTCCGACCTGAT.PCR条件如下:下min;下s,下s,下s,运行个循环后下min.RTPCR分析在RNAi转基因植株的表达分析中,RNA从水稻植株的叶片中提取;在水稻组织特异性表达分析中,RNA分别从水稻根、茎、叶、茎顶端分生组织、不同时期的幼穗中提取,反转录成cDNA后用于实时PCR和RTPCR模板.引物序列均为OsHoxF:GCTCGGAGAAGACAACAATG;OsHoxR:GCACACACTCTTTACAGGCA.实时PCR按照SYBRGreenPCR预混液(Tiangen,北京)试剂盒说明操作,并用Ct方法进行相对定量分析,重复次.实时PCR扩增条件为下min;下s,下s,个循环.RTPCR反应条件为下min;下s,下s,下s,运行个循环后下min.以水稻OsActin内参相对定量,内参基因引物为OsActinF(GACTCTGGTGATGGTGTCAGC)和OsActinR(GGCTGGAAGAGGACCTCAGG).RTPCR反应条件为下min;下s,下s,下s运行个循环后下min.OsHox的亚细胞定位对于瞬时表达载体的构建,RNA从d秧龄水稻幼苗茎顶端分生组织中提取,PCR扩增中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)OsHox完整ORF(去除终止密码子),所用引物为FHoxF(TTAgagctcTGGTGGTGGAGGAGGAGGAT)和FHoxR(ACTgtcgacCACGAAGGACCAGTTGACGA)(小写字母为酶切位点序列),PCR条件为下s;下s,下s,下min运行个循环后下min.扩增的特异片段克隆到空载体pCAMBIAS:GFP中与GFP基因融合.测序鉴定正确的目的载体pCAMBIAS:OsHoxGFP注射烟草叶片,注射d后在共聚焦显微镜下观察.结果与分析OsHoxRNAi表达载体的构建为了揭示OsHox的功能,通过构建RNAi载体进行反向遗传学分析(图A).bpOsHox特异干涉片段利用RTPCR方法从水稻幼苗中获得,通过凝胶电泳检测发现目的条带符合我们预期结果(图B).首先将正向特异干涉片段用BamH和Kpn与RNAi空载体pCAMBIA连接后获得中间载体,再将反向特异干涉片段用Spe和Sac与获得的中间载体连接获得最终的pCAMBIAOsHoxRNAi表达载体.连接好的重组载体进行酶切鉴定,按预期用BamH和Sac可切出约bp的片段,酶切结果与预期相符(图C),说明正向和反向目的片段已连接到空载体中;进一步用PCR方法验证,结果表明每个克隆都扩增出了预期的bp大小的目的条带(图D),后经测序验证表明特异干涉片段已正确连接到载体中,可以进行下一步的转基因工作.转基因植株的PCR检测将构建好的pCAMBIAOsHoxRNAi载体用农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻品种中花中,共获得了个独立株系的株T代RNAi转基因植株.为了检测构建的RNAi载体是否整合到水稻基因组中,我们提取这些转基因植株的基因组DNA,用载体中特异的潮霉素基因引物,对T代转基因植株进行PCR检测,结果表明株转基因植株中有株为转基因阳性植株(图),阳性率约为.转基因植株的表型观察及表达分析随机种植个独立T代RNAi转基因阳性植株获得T代转基因株系,观察T代转基因株系表型发现个株系中有个株系株高变矮,分蘖数减少,并且抽穗日期有所推迟(图A、B).另外,转基因植株的结实率也有所下降.为了验证转基因植株表型是否由RNAi干涉所致,从植株叶片中提取ARNAi载体结构;LBTDNA左边界;pS花椰菜病毒S启动子;OsHoxOsHox正向特异干涉片段;AntiOsHoxOsHox反向特异干涉片段;Loop内含子序列;RBTDNA右边界;BOsHox特异干涉片段PCR扩增.C构建好的RNAi载体的酶切鉴定.DRNAi载体PCR鉴定;分别代表RNAi重组载体质粒;P空载体质粒;MDNA标记.A,RNAivector;LB,LeftborderofTDNA;pS,Spromoterofcaulimovirus;OsHox,ForwardinterferencefragmentofOsHox;AntiOsHox,ReverseinterferencefragmentofOsHox;Loop,Intronsequence;RB,RightborderofTDNA;B,AmplificationofOsHoxinterferencefragmentbyPCR;C,DetectionofenzymedigestioninRNAivector;D,DetectionofPCRinRNAivector;,RNAirecombinantplasmid;P,Blankplasmid;M,DNAMarker图RNAi载体的构建FigConstructionofRNAivector艾丽萍等:水稻同源异型域转录因子OsHox的反向遗传学分析分别代表T代RNAi转基因植株;PRNAi重组载体质粒;WT野生型中花;CKddHO.,RNAitransgenicplants(T);P,RNAirecombinantplasmid;WT,WildtypeZhonghua;CK,ddHO图T代RNAi转基因植株PCR检测FigPCRdetectionoftheRNAitransgenicplantsofTgenerationA抽穗期;B成熟期;WT野生型中花;RNAi转基因植株;C和DRNAi转基因植株RTPCR和实时PCR表达分析;分别代表个独立T代RNAi转基因植株.A,Headingstage;BMaturestage;WT,WildtypeZhonghua;RNAi,Transgenicplants;CandD,RTPCRandrealtimePCRanalysisofOsHoxexpressioninRNAitransgenicplants;,RNAitransgenicplantsofTgenerationderivedfromindependentTgeneration图RNAi转基因植株的表型及表达分析FigAnalysisofphenotypeandexpressioninRNAitransgenicplants个独立株系转基因植株的RNA,用实时定量PCR和RTPCR的方法检验OsHox表达量.结果表明OsHox在有表型的、三个株系中表达量明显降低(图C),而在没有表型或表型不明显的转基因株系(,)中表达量与野生型植株基本相当(图C,D),说明RNAi载体可以正常工作,RNAi转基因植株的表型是由OsHox表达受到干涉造成的.OsHox基因在水稻中的组织特异性表达分析为了确定OsHox在水稻不同组织器官中的表达,分别提取水稻茎顶端分生组织、不同时期幼穗、根、茎、叶的总RNA,反转录后用RTPCR检测其在水稻组织器官中的表达.结果表明OsHox在水稻各个组织器官中均有表达,但表达量有差异.比较而言,在茎顶端分生组织及早期幼穗中表达量较高(图),但在根和叶中表达量较低.OsHox亚细胞定位分析同源异型域转录因子在植物中的功能复杂,为了解OsHox在细胞中起作用的部位,我们构建了绿色荧光蛋白GFP与目的基因ORF融合载体.OsHox完整ORF序列(去除终止密码子序列)用RTPCR方法从水稻茎顶端分生组织cDNA中获得,测序验证无误后连入空载体pCAMBIAS:GFP中与GFP读码框融合,载体经测序验证后转入农杆菌中,然后注射烟草进行瞬时表达.激光共聚焦显微镜观察结果表明,pCAMBIAS:中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)M茎顶端分生组织;Pcm幼穗;Pcm幼穗;Pcm幼穗;R根;S茎;L叶.M,Stemapicalmeristem;P,cmlongpanicle;P,cmlongpanicle;P,cmlongpanicle;R,Root;S,Stem;L,Leaf图OsHox在水稻不同器官中的表达FigExpressionofOsHoxindifferentorgansofriceOsHoxGFP融合表达载体在烟草表皮细胞的细胞膜强烈表达(图B),另外,在气孔细胞膜上也有强烈表达(图C),而在空载体对照pCAMBIAS:GFP中,GFP荧光在整个细胞内均有表达,没有特异性(图A).表明OsHox转录因子在细胞膜上起作用,另外其在气孔中起作用说明OsHox可能在水稻叶片中有很重要作用.讨论HDZip转录因子在植物的发育进程中起重要的调控作用,有着复杂多样的生物学功能.例如拟南芥AtHB转录因子调控叶片发育,AtHB调控叶片形态发育、下胚轴的延伸、植株开花时间等.AtHB调控细胞分裂与分化,AtHB调控维管组织的早期发育.胡萝卜胚胎发育也受到HDZip转录因子CHB/的调控,其中CHB在胚胎早期发育中起作用.番茄VaHox转录因子调控形成层细胞到韧皮部的分化.HDZip转录因子还具有对外界环境胁迫信号的应答生理功能,例如拟南芥AtHB和AtHB调控光敏素相关的光控制的生物过程,如诱导叶绿素的合成适应弱光照等.水稻中转录因子HDZip蛋白家族的功能还不明确,为了揭示其在水稻生长发育中的功能,我们构建了OsHox的RNAi表达载体,导入水稻中获得转基因植株,利用反向遗传学方法对HDZip家族中的OsHox基因功能进行了初步探索.结果表明OsHox在功能敲除条件下影响水稻生长和发育,转基因植株表现株高降低,生育期推迟.OsHox基因组织特异性表达表明其在茎顶端分生组织、幼穗中表达量较高,与前人研究结果一致.虽然OsHox是一个转录因子,我们的研究结果表明其在细胞膜上发挥作用,尤其在叶片气孔中有强烈的表达信号,说明该转录因子可能对于水稻叶片的发育及生长起重要作用,但该基因如何调控水稻的生长发育目前仍不清楚.下一步的研究,尤其是OsHox转录因子与其下游基因的相互作用的研究,将有助于揭示OsHox在水稻生长发育中的功能,对于全面洞察HDZip转录因子家族在植株中的功能具有重要意义.A空载体pCAMBIAS:GFP对照;B和CpCAMBIAS:OsHoxGFP融合表达载体;B烟草表皮细胞细胞膜上表达;C气孔细胞膜上表达.A,pCAMBIAS:GFPemptyvetor;BandC,pCAMBIAS:OsHoxGFPfusionvector;B,GFPexpressedonthecellmembraneofepidermalcell;C,GFPexpressedonthecellmembraneofstoma图OsHox亚细胞定位FigSubcellularlocalizationanalysisofOsHox艾丽萍等:水稻同源异型域转录因子OsHox的反向遗传学分析参考文献:JohannessonN,WangY,EngstrmPDNAbindinganddimerizationpreferencesofArabidopsishomeodomainleucinezippertranscriptionfactorsinvitroPlantMolBiol,():RamachandranS,HiratsukaK,ChuaNHTranscriptionfactorsinplantgrowthanddevelopmentCurrOpinGenetDev,():MeijerAH,ScarpellaE,vanDijkEL,etalTranscriptionalrepressionbyOshox,anovelhomeodomainleucinezipperproteinfromricePlantJ,():ChanRL,GagoGM,PalenaCM,etalHomeoboxesinplantdevelopmentBiochimBiophysActa,():ArielFD,ManavellaPA,DezarCA,etalThetruestoryoftheHDZipfamilyTrendsPlantSci,():SodermanE,HjellstromM,FahlesonJ,etalTheHDZipgeneATHBinArabidopsisisexpressedindevelopingleaves,rootsandcarpelsandupregulatedbywaterdeficitconditionsPlantMolBiol,():SodermanE,MattssonJ,EngstromPTheArabidopsishomeoboxgeneATHBisinducedbywaterdeficitandbyabscisicacidPlantJ,():IngramGC,BoisnardLorigC,DumasC,etalExpressionpatternsofgenesencodingHDZiphomeodomainproteinsdefinespecificdomainsinmaizeembryosandmeristemsPlantJ,():OhashiItoK,DemuraT,FukudaHPromotionoftranscriptaccumulationofnovelZinniaimmaturexylemspecificHDZiphomeoboxgenesbybrassinosteroidsPl