转基因鲤的生态安全检测.doc

转基因鲤的生态安全检测自1984年朱作言等成功建立鱼类转基因模型以来，许多国家相继开展了转基因鱼的研究，并取得了一定成果，鱼类基因转移技术的成功展示了鱼类基因工程育种研究的广阔前景，转基因鱼也因其具有的优越经济性状和巨大的经济效益，受到了人们的极大关注，然而转基因鱼要进入商业化生产还有一系列难题尚未解决，其中生态安全就是人们高度重视的难题之一，与转基因植物和转基因哺乳动物比，鱼类具有特殊性，其活动的地域广泛，释放到水体中，几乎不能回收，若转基因鱼不断逃逸到天然水体中，可能会导致大量外源基因进入其野生同种或相近种基因组中，随着种群的进一步扩大，可导致遗传同化，干扰其野生同种或相近种的遗传背景，对种群的生态平衡产生难以估量的影响，因此，转基因鱼生态安全性评价和检测方法的基础研究势在必行，目前一些研究小组正在进行转基因鱼的中试研究，为商业开发做准备，但相关的安全性研究却是空白，关于转基因植物生态安全国内外学者做了一些基础研究，如杂交是否亲和、基因漂移距离、影响花粉传播的因素等，但未见到有关转基因鱼生态安全检测的报道，国外对转基因鱼做过净适合度方面的相关实验，并建立了转基因鱼的基因飘散模型，但是没有进行基因组变异方面的检测，笔者按一定比例将转基因鲤与养殖鲤混合进行自然交配，应用AFL P方法对其子一代基因组进行扫描分析，同时以养殖鲤、野鲤和松花江哈尔滨江段鲤作为参照，检测不同比例的转基因鲤亲本对与养殖鲤交配的子一代基因组的变化，通过遗传多样性，遗传相似度和遗传距离等遗传学参数分析子一代基因组的变异程度，评价转基因鲤的安全性1材料和方法1.1材料1.2 DNA的制备及纯度检测1.3 AFLP实验1.3.4 PCR扩增预扩增引物为1.4数据处理2结果2.1 AFLP扩增指纹图谱2.2多态位点及种内遗传多样性参数2.3群体间遗传距离及遗传分化度3讨论3.1遗传多样性水平一个物种群体内的个体基因水平互有差异，即遗传多样性，通常表现出各种遗传变异，进而反映物种的进化潜力及对环境的适应性，本研究采用AFLP方法对8个鲤群体进行分析，结果显示8个群体的遗传多样性略偏低，Neis多样指数在0.2545到0.2076之间，Shannon信息指数在0.3049到0.3737之间，对8个群体的。，。和I比较显示，都是Y组最高，H组最低，总的趋势是YDZ1% 10%25%50%60%H多态位点的变化也具有相同的趋势，说明随着转基因亲本所占比例的增加，群体的遗传变异在减少，遗传多样性在变小，这是由于Y组是抚远江段的野鲤，属于野生种群，遗传资源尚未遭到破坏，保持了良好的遗传多样性DZ养殖鲤多样性要低于野生鲤，一是由于养殖鲤是人们经过多代选育形成的，在累代选育中都筛选具有典型优良性状的少量后代作为亲本，这样就不可避免的造成了后代的基因组多态性降低；二是长期的人工养殖实践，使养殖鲤处于简单的生态环境下（池塘养殖条件），维持生存和生长过分的依赖于不变环境条件，适应环境变化和基因突奕的发生率减少导致多态性下降，而笔者使用的转基因鲤亲本是由外源大马哈鱼生长激素基因转入养殖鲤鱼受精卵所得，由于外来基因的插入和不定点整合，改变了供体亲本基因组的结构，形成了一个新的群体，当其与养殖鲤进行杂交时，随着转基因亲本比例的增加，子一代的遗传特点就越倾向于转基因鱼，本实验结果显示随着转基因亲本比例的增加其遗传多样性变小，可以推测得出转基因鱼由于转入了外源基因，破坏了原有的基因组结构，使其遗传多样性降低5个转基因实验组的遗传多样性要高于H组，即松花江哈尔滨江段的鲤，造成松花江哈尔滨江段的鲤的遗传多样性小的原因可能有2种：一是因为养殖鲤群体的入侵，与野生鲤交配导致多样性条带丢失，遗传多样性下降；二是由于过渡捕捞及生态环境的破坏使松花江哈尔滨江段的鲤的群体数量迅速减少，产生了生殖瓶颈效应，使某些基因从基因库中丢失，其多态性降低，由此可见转基因鱼如逃逸到自然界中，会对原有种群的遗传多样性产生影响，且随着转基因亲本数目的增加，其影响也在增加，但就笔者检测的结果看，转基因鱼对养殖鲤的影响要小于目前各种因素包括养殖的杂交鲤、人为的资源、环境破坯对松花江哈尔滨江段的鲤的影响3.2遗传距离分析AFLP的优点之一是能显现出大量的多态性DNA片段，遗传距离估算的精确性将随着分析位点数的增加而增加，本研究检测了663个位点，并对所有群体和每2个个体做了遗传距离和相似性分析Thorp23通过分析研究认为不同物种间的遗传相似系数I=0.20.8（遗传距离D。=0.20.8）；同科属群体间I=0.50.9(D。=0.10.5)；同种群体间I=0.80.97(D。=0.030.2)本研究的8个群体之间遗传相似系数I=0.79160.8740之间，(D。=0.13470.2337)，理论上讲这8个群体应该属于同一种群，但是数据显示，与分类标准有些差异，可能是由于不同比例转基因鲤对其后代产生了较大的影响，特别是60%实验组I=0.79160.819I(D。=0.19960.2337)已经超出了同一种群的范围；50%实验组I=0.80530.8588(D。=0.15220.2166)与25%实验组I=0.79160.8353 (D。=0.18000.2337)也在不同程度上超出了同一种群的范围；DZ组和Y组的遗传距离为0.1867，小于25%，50%，60%组和Y组的遗传距离，同样的DZ和H组的遗传距离小于50%，60%组与H组之间的遗传距离，可见当转基因亲本的比例较小时对子代的的影响不足以表现出来，但是随着亲本比例的增加影响变大，有重建种群的趋势，在用养殖鲤构建转基因鱼时，外源基因的插入在不同程度上导致了内源基因组结构的改变，致使某些酶切位点改变甚至丢失，使其与杂交鲤的相似性变小，遗传距离变大，1%，10%，25%，50%和60%实验组是养殖鲤与转基因鲤的后代，在不同程度上遗传了亲本的特性，转基因亲本的比例越大就越接近转基因鱼的特性，所以1%，10%，25%，50%和60%实验组在相似性和遗传距离上不同程度的偏向于转基因鲤，特别是60%实验组，已经与H组和Y组产生了较大的差距，而且比养殖鲤与野生鲤的遗传距离大，以上数据可以看出混有不同比例的转基因鲤的后代基因组受到不同程度的影响，转基因比例越大表现出的越明显，甚至影响到了种群的划分，高比列的转基因亲本对养殖鲤的基因组结构影响较大3.3遗传结构与基因流基因流(。)揭示了群体间基因渗透及影响遗传分化的遗传现象，基因流的变化离不开环境变化产生的选择作用，它使群体间基因及其频率相对稳定，许多学者认为，在基因流发生较少的地方，将来有希望产生特异的群体，如地理型、亚种、变种，根据鲤的生活和繁殖习性，基因流主要来源于环境的选择效应和群体的迁移，它对形成群体的遗传结构和基因流的强度有着密切的关系，基因流与遗传分化度成反比例关系，本研究发现实验组遗传分化度均小于0.5，且随着转基因亲本的比例增加，1%，10%，25%，50% ,60%实验组与H组和Y组间遗传分化度在增大，基因流在变小，就是说群体的遗传多样性主要来源群体内部，且随转基因亲本比例的增加，来源于群体间的多样性在增加，根据HamrickE241等的观点，Nm大于1时，基因流就足以抵制遗传漂变的作用，也同时防止了群体分化的发生；若Nm小于1，漂变就成为刻划群体遗传结构的主导因素，在本研究中，不同比例转基因亲本与养殖鲤繁殖所得子代与野生鲤之间的基因流Nm都大于1，因此转基因子代基因组的变化是由双亲引起的，还没产生遗传漂变8个鲤群的遗传分化度(Gs。)较高，群体间存在一定程度的遗传分化，群体间变异占总变异的34.49%基因流为0.9498（小于1），每2个群体间的基因流在1.1352到2.3593之间，张春霖等报道青海湖裸鲤的遗传分化系数为0.1084，基因流为4.1114，与此相比鲤群体具有较高的基因分化系数，且基因流较低，这可能与其生活习性有关，青海湖裸鲤属于生殖洄游的鱼类，而鲤属于非洄游性鱼类，地理隔离可以导致群体间的遗传分化系数增大，基因流值降低，另一方面群体间的基因流可能由于环境恶化和人类活动（过度捕捞、修建水库）等造成的栖息地的片段化，生境片段化使各群体在空间上相对隔离，在个体的迁移能力不变的情况下，基因流将降低，隔离距离越大，群体间的基因流越小，从而导致群体间的遗传分化增大可以认为，历史上野生鲤是广泛分布的，基因在群体间有广泛的交流，但随着近期的人为干扰、破坏和资源的过度开发利用，使得鲤的生境片段化，造成有效群体较小，导致群体内遗传多样性下降，群体间遗传分化较大，鲤的遗传分化程度较高，群体间基因流动较弱，易受环境变化、遗传漂变等随机因素影响，应尽可能避免人为加速生境的片段化，而使基因流降低，同时避免高比例的转基因鲤的混入，高比例转基因鲤亲本、子代与野生鲤鱼的基因流要小于养殖品种与野生鲤的基因流，由此可见，转基因鲤对野生鲤产生的群体分化的影响要高于养殖群体对野生鲤的影响，这是因为转基因鱼基因库中有外来的基因，而人工养殖群体基因库却是鲤本身原有的基因，虽然由于人工选择、杂交等因素形成了新的群体，改变了原有基因组的结构，但群体分化影响还是较少的，基因工程在造福人类的同时也带来了一定的灾难，因此必须从保障人类健康、发展农业生产和维护生态平衡与安全的角度出发，提出具有指导意义和行之有效的措施，目前，转基因鱼都是在有效的监控下开展研究和养殖，对自然生态环境的影响是微弱的，但是也存在逃逸的风险，一旦转基因鱼逃逸到开放水体中，对环境中同种或相近种遗传背景的干扰是不能消除的，由本研究的检测结果可以看出，高比例的转基因鱼会对其后代基因组产生明显的影响，要注