利用免疫荧光染色观察转入YFP-PKCθ的E6.1细胞 在CD3CD28抗体刺激下活化的影响——毕业论文

利用免疫荧光染色观察转入YFP-PKC的E6.1细胞在CD3/CD28抗体刺激下活化的影响摘要：T细胞在接受CD/3CD28共刺激信号的作用下，表面蛋白会聚集成帽状结构。本实验通过免疫荧光染色法，观察转入PKC的T细胞在及是否接受CD3/CD28信号刺激等不同条件下，在IgG辅助时活化的影响。结果显示转入PKC的细胞会形成明显的帽状结构，而空白对照组没有，显示PKC对T细胞活化的促进作用。关键词：PKC；CD3/CD28；T细胞在T细胞中,PKC是诱导AP-1活化的信号途径中的重要因子。而同时，c-Jun蛋白N-末端激酶(JNK)的活性可以激活AP-1。PKC能够在T细胞特异性的活动中活化JNK,而PKC的其他亚型则没有这个功能。T细胞的TCR和CD28信号途径都需要JNK的活性1-2。TCR四种亚基的胞质部分均很短,不具有传递抗原刺激信号的能力,但可通过与CD3分子形成TCR /CD3复合物,传递细胞刺激信号。由于TCR与IgG结合后，膜上的TCR /CD3与CD28、LFA-1等各种跨膜辅助受体很快聚集并形成集中有序的富含鞘磷脂和胆固醇的脂筏(raft)微区，故在显微镜下为可见荧光的弧线状的capping结构3。CD3/CD28刺激T细胞的原理，是在CD3抗体刺激T细胞后，使细胞发生钙离子浓度升高，磷脂分解等。然后CD28提供第二信号的刺激，使得TCR/CD3复合物能实现上述信号传递过程，形成capping4。因此，用YFP标记的PKC在CD3/CD28抗体刺激后，加入的IgG可将CD3和CD28形成一个集群聚集在膜上，刺激后可以使得PKC上膜与之聚集。所以，一系列的级联反应的后果就是，转染了YFP-PKC的细胞，其表达的YFP-PKC蛋白在CD3/CD28刺激的情况下被激活而上膜，与CD3/CD28聚在一起，所以在膜上形成了YFP荧光的capping结构。1 主要材料方法1.1 材料质粒提取试剂（Magen公司）电转：Lonza4DNucleofector细胞核转染仪显微镜观察：Zeiss倒置荧光显微镜 （Zeiss公司）Jurkat E6.1细胞：悬浮的 T 细胞系YFP-PKC和YFP-C1质粒含10%FBS的RPMI-1640培养基免疫组化笔IgGCD3/CD28抗体1.2 方法质粒提取：利用Magen公司的HiPure Plasmid EF Micro Kit 方案进行无内毒素质粒提取。电转：取含有3106个细胞的培养液，在200g条件下离心5min；进行Hanks洗涤后，再于200g条件下离心5min；电转Buffer重悬细胞。将细胞与提取好的3g/杯的YFP-PKC和YFP-C1质粒混合后，在Lonza4DNucleofector细胞核转染仪进行电转。电转后，讲细胞转移至预先预热至37的35mm dish，3mL/dish 的含10%FBS的ROMI-1640培养基中。E6.1细胞培养：在37 5%CO2下培养细胞约48小时PLL包被的载玻片准备：用免疫组化笔在干净的玻片上画两个圈，晾干5min后，每个圈内加入50L PLL，室温孵育15min，真空泵吸除，37烘箱烘干。收细胞：取5105细胞，200g离心5min，去上清后用100L无FBS的RPMI-1640重悬，冰上静置15min。刺激细胞：加入终浓度为10g/mL的CD3抗体和终浓度为2g/mL的CD28抗体，冰上孵育10min后，加入10g/mL的IgG进行交联。迅速放置于thermomixer 37 8000rpm/min 离心5min。铺细胞：4 8000rpm/min 离心30s终止刺激，去上清后用100L含10%FBS的RPMI-1640重悬细胞，并置于孔中，室温静置20min。固定细胞：4% PFA固定细胞15min。渗透：0.2% Triton-X 100渗透 10 min。封闭：2% BSA封闭30min 染细胞核：用DAPI进行5min细胞核染色封片：经PBS洗涤后封片。显微观察：在显微镜下依次观察未刺激的转入YFP-C1的细胞、已用CD3/CD28抗体刺激的转入YFP-C1的细胞、未刺激的转入YFP-PKC的细胞和已用CD3/CD28抗体刺激的转入YFP-PKC的细胞。2 结果图1：C1PKC（细胞核与PKC荧光） （PKC荧光）（细胞核与PKC荧光） （PKC荧光）（-） （细胞核与PKC荧光） （PKC荧光） （细胞核与PKC荧光） （PKC荧光）（+）如图，为荧光显微镜下观察到的细胞核荧光（蓝色）与PKC荧光（绿色）。未刺激的转入YFP-C1的空载细胞，表面的未有绿色荧光聚集现象。说明在空白对照条件下，T细胞表面的蛋白不发生聚集，显微镜下不能观察到capping。未刺激的转入YFP-PKC的细胞同理，由于没有经过CD3/CD28的刺激，不能观察到capping。而经过刺激的空载T细胞未形成capping，经过刺激的转入YFP-PKC下形成capping。同时本实验做了流式细胞术检测作为辅助确定手段。结合流式细胞仪数据（图2）可看出，即转入PKC后被活化的T细胞数目与对照组的活化的T细胞数目比例约为2.6倍。图2：3.讨论3.1 本实验利用转入C1的空载细胞对照，探究转入PKC质粒对T细胞受刺激信号刺激后活化的影响。利用YFP序列修饰过质粒标记表达出的PKC蛋白，使其可在荧光显微镜下观察到刺激作用后细胞表面的受体分布状况，从而直观地得出T细胞活化的影响。结合流式细胞仪的数据，可以全面得出转入PKC后对T细胞活化的影响。3.2 实验过程中，细胞生长情况良好，未受到细菌污染。但在制片时，最后一步压片步骤盖上盖玻片之后，对盖玻片进行了轻微的挪动，使得细胞有一定程度变形，故在显微镜下只能找到较为少数的可观察的细胞。且观察过程中，荧光物质有一定程度的淬灭，故绿色荧光观察时亮度较暗。3.3 在没有受到刺激的情况下，转入了YFP标记的PKC的细胞，相比于空载细胞，绿色荧光较弱，是因为YFP-PKC质粒长度相比较于YFP-C1质粒长度较长，更难表达。所以荧光较弱。而在刺激条件下，由于转入PKC质粒的细胞的抗体集群，而空载细胞抗体不集群，无法对比二者强度。3.4 在未刺激的条件下，绿色荧光在细胞上大致均匀分布，表明了在没有CD3/CD28刺激的情况下，T细胞对于IgG不进行识别，细胞膜上无法聚集CD3/CD28蛋白，即T细胞不会在没有CD3/CD28刺激的情况下被活化。3.5 观察没有受到刺激的细胞，在同时观察细胞核荧光和PKC蛋白荧光的情况下，蛋白的绿色荧光不明显，需要单独观察PKC的荧光通道才可看到绿色荧光的分布。表明了在没有受到刺激的情况下，T细胞可能表达PKC蛋白较少。3.6 观察受到刺激的细胞，空载细胞不形成capping，而转入PKC的细胞可形成capping，结合3.4可知，T细胞受到CD3/CD28刺激后，在IgG辅助下，细胞膜上会聚集CD3/CD28蛋白。然后引导PKC蛋白上膜，形成发出绿色荧光的capping。由于空载细胞内源PKC蛋白较少，故无法观察到capping。3.7 从流式的数据辅助讨论可知，空载细胞没有收到刺激时活化的只有0.588%，转入PKC的细胞活化的只有2.00%，说明在未刺激时活化水平很低，无显著差异。是否转入PKC对细胞不接受刺激时活化影响不明显。而在接受了CD3/CD28刺激后，空载细胞活化率31.9%，转入PKC的细胞活化率83.0%，有了2.6倍的明显提升。3.8 综合可知T细胞中的PKC可以与CD3/CD28集群聚合，从而使T细胞活化，而转入的PKC对于T细胞活化起了促进作用，能使细胞活化率提高约2倍以上。致谢：谢谢李迎秋老师，让我有了能走进实验室，了解现在科研的一些常识，锻炼自己实验能力的一次珍贵的机会。感谢实验室师兄在实验过程中悉心指导和耐心解惑。参考文献1杜丽蕊. PKC在T细胞活化和IL-2表达中的作用J. 国外医学(免疫学分册)，2004（06）：346-350.2J. Huang, P. F. Lo, T. Zalet al. CD28 plays a critical role in the segregation of PKC theta within the immunologic synapse. P