硕士毕业论文范文——多肽佐剂对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用

分类号： 单位代码： 密 级： 学 号： 学位论文多肽佐剂对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用Immunologic enhancement of polypeptide adjuvant for inactivated avian influenzavaccineinactivated研究生： 指导教师： 合作指导教师： 申请学位门类级别： 农学硕士 专业名称： 预防兽医 研究方向： 所在学院： 动物医学院 年 月摘要本研究将T细胞多肽添加到禽流感灭活疫苗中以增强其免疫原性，提高禽流感灭活疫苗的免疫保护作用。为了验证T细胞表位多肽对于禽流感疫苗的这种免疫增强作用，进行了四次动物实验。采用禽流感灭活疫苗和T细胞表位多肽一同免疫SPF鸡，分别在免疫后第21天，28天，35天和42天采血，测量其抗体效价。实验发现，T细胞表位多肽可以在禽流感灭活疫苗免疫后21-28天内显著提高抗体效价，但在免疫后第42天，这种增强作用便观察不到了。实验还测量了被免疫SPF鸡单位体重的脾脏和法氏囊的重量，实验组与对照组之间存在显著性差异（p0.05）。此外，为了探究T细胞表位多肽对于禽流感灭活疫苗免疫增强作用的机制，通过定量PCR的方法，分析了T细胞表位多肽对于细胞因子IFN-和IL-4分泌水平的影响，发现T细胞表位多肽在免疫后21天可以提高IFN-和IL-4的分泌水平，其差异可达到显著水平（p0.01），同样的，在免疫后第42天，IFN-和IL-4的分泌水平恢复至与对照组相同的水平。综上所述，T细胞表位多肽对于禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。关键词：多肽 佐剂 禽流感 疫苗AbstractIn this study, the T cell peptide was added to the avian influenza inactivated vaccine as adjuvant in order to enhance its immunogenicity, and enhance the immune protection effect of the avian influenza inactivated vaccine. In order to verify the enhancement of T cell epitope peptide for the avian flu vaccine, four animal experiments were carried out. SPF chickens were immured with inactivated avian influenza vaccine and T cell epitope peptide. Blood was drawn at 21days, 28days, 31days and 42days after the immunization respectively to measure the antibody titer. Results show that, 21-28 days after immunization T cell epitope peptide in the avian influenza inactivated vaccine immunity significantly improve antibody titer, but at 42 days after immunization, this enhancement was not observed. The experiment also measures spleen and bursa of SPF chickens immunized per body weight, there was a significant difference between the experimental group and the control group (p0.05). In addition, in order to study on the mechanism of this immune enhancement, real-time PCR was performed to study on the influence of T cell epitope peptide on the cytokines IFN- and IL-4 secretion. Results show that the 21 day after immunization can increase the secretion of IFN- and IL-4, the difference is significant (p0.01), and on the forty-second day after immunization, the secretion level of IFN- and IL-4 recovered to the same level with the control group.In summary, T cell epitope peptide could enhance the immunological function of the avian influenza inactivated vaccine.Key words: peptide adjuvant avian influenza vaccine目录摘要IAbstractII目录III缩略词表IV第一章 引言11.1 禽流感11.2 常见的佐剂类型及特点11.3 流感病毒的抗原表位研究进展51.4 多肽合成方法71.5 研究目的与意义9第二章 T细胞表位多肽的合成102.1引言102.2材料102.3方法112.4结果13第三章 T细胞表位多肽对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用143.1引言143.2材料143.3方法153.4结果193.5讨论30第四章 T细胞表位多肽对鸡血液中细胞因子分泌情况的影响314.1引言314.2材料314.3方法324.4结果344.5讨论36第五章 结论37参考文献38致谢42作者简介43缩略词表缩略词英文全称中文全称AIVavian influenza virus禽流感DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核苷酸cDNAcomplementary DNA互补脱氧核糖核酸ggram克hhour小时HAhemagglutinin血凝素HPAIHighly pathogenic avian influenza高致病性禽流感HPLCHigh Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法IFNInterferon干扰素IL-4Interleukin 4白细胞介素4kgkilogram千克mgmilligram 毫克minminute分钟mlmillilter毫升NAneuraminidase神经氨酸酶NSnon-structural protein非结构蛋白PAacidic polymerase protein 聚合酶蛋白APB1basic polymerase protein 1聚合酶蛋白B1PB2basic polymerase protein 2聚合酶蛋白B243中国农业大学硕士论文 第二章 T细胞表位多肽的合成第一章 引言1.1 禽流感目前对禽流感的预防和控制，各个国家采取了不同的措施，多数国家政府禁止或不提倡使用禽流感疫苗。近年来随着分子生物学和免疫学等学科的飞速发展，各种新型疫苗的相继问世，人们不断寻求一种安全高效的新型禽流感疫苗。在我国，目前仍以疫苗免疫作为防控禽流感的主要措施。禽流感疫苗的种类很多，有全病毒灭活疫苗，亚单位疫苗，重组活载体疫苗以及DNA疫苗等，其中应用最为广泛的是禽流感全病毒灭活疫苗。灭活苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续期长等特点，已经被很多国家作为商品化的禽流感疫苗在家禽中使用。 然而，虽然全病毒灭活苗能诱导机体产生有效的免疫应答反应，能够有效控制禽流感的大流行，但灭活苗需要的抗原剂量较大，使用中需要添加佐剂提高抗原的免疫原性和刺激机体的先天免疫系统。通常认为在采用疫苗免疫后，抗体效价达到6以上能够对易感动物产生有效保护，因而如提高疫苗的免疫原性，使免疫后抗体效价迅速达到6以上，以及如何长时间维持抗体效价的水平在6以上，是禽流感疫苗研究的重点。佐剂是指某些抗原有关的物质，单独或同时与抗原使用时能增强机体的免疫应答，并能通过非特异性途径改变或增强机体对抗原物质产生特异性免疫应答的物质。人们通过通过添加佐剂的方法提高禽流感疫苗的免疫原性，并长时间维持一定的抗体水平。此外，目前使用的禽流感灭活疫苗很难激活先天免疫系统和高水平的细胞免疫，添加佐剂也可以刺激机体产生一定的的细胞免疫应答。研究表明，佐剂的使用可以增加抗原的免疫原性，并对有关的流感病毒产生交叉性的保护。 目前，商业化禽流感灭活苗中应用的佐剂主要为矿物油佐剂。国内外文献中提到的流感灭活苗的佐剂主要有铝佐剂，矿物油佐剂，多糖类，皂苷类，细胞因子类（IL-2，IFN-等），CPG基序，polyI:C，胞壁酰二肽类，咪喹莫特类等。1.2 常见的佐剂类型及特点1.2.1 铝佐剂铝佐剂是目前应用最为广泛的佐剂，其安全性和高效性得到人们的公认，是目前FDA最早批准的可以用于人用疫苗的佐剂。1926年，Glenny首次提出，他用明矾沉淀白喉类毒素作为抗原免疫豚鼠，取得了较强的免疫效果1, 2。铝佐剂包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂两种，其中氢氧化铝的使用更为广泛。氢氧化铝佐剂是一种纤维状粒子，大小约4.5nm2.2nm10nm，等电点为11.4，这些粒子松散地聚集在一起，以约110um大小的形式存在。强氧化铝佐剂的铝羟基可以提供或接受质子，因而具有两性化合物的特性，在不同的PH条件下可以很好的吸附抗原。关于铝佐剂的作用机理，目前主流的理论是氢氧化铝吸附抗原制备的疫苗在注射部位具有缓慢释放的功能，因而对抗原的吸附力大小是衡量佐剂效果的一项重要指标。此外，Rimaniol提出氢氧化铝佐剂能够刺激巨噬细胞分化成一种特殊的抗原呈递细胞，有别于树突状细胞3。Li等研究发现，铝可以激活与细胞内源性免疫应答相关的Nalp3炎性复合体，促进巨噬细胞分泌促炎因子IL-1和IL-184。Eisenbarth等则通过进一步的研究发现，氢氧化铝佐剂还可以激活Th2细胞分泌IL-4，诱导MHC-类分子和CD83,CD86等的表达，诱导Th2型体液免疫应答5。然而铝佐剂不适用于核酸疫苗等新型疫苗，无法冻干，不利于贮存和运输，质量不稳定，难以控制，且无法对其效果作出准确的评价。此外，由于铝佐剂诱导产生Th2型体液免疫应答，促进抗体的分泌，无法诱导产生有效的细胞免疫应答。而诱导产生的高水平IgE，又增加了发生型超敏反应的危险。Frey等将Al2O3制备成吸附能力更强的纳米颗粒，再将HIV-lgp120的C4区首尾连接成多肽共聚物作为抗原，共价偶联于纳米Al2O3上以提高其免疫原性，结果发现可以诱导产生更高的抗体滴度6。此类将铝佐剂制备成纳米颗粒的研究很多，大都证明采用纳米铝佐剂，可以减少佐剂用量，减轻不良反应，提高免疫效果。Kreuter等通过研究发现，将蛋白抗原与纳米粒子偶联后，纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时可以稳定抗原结构，促进淋巴结对抗原的摄取，在兔体内引起强烈的特异性免疫应答。除铝佐剂外，常见的矿物质佐剂还有磷酸钙佐剂、硒佐剂和氢氧化铁凝胶佐剂等7。1.2.2 油乳佐剂油乳佐剂来源广泛，成本适中，也是目前使用较为广泛的佐剂之一。早期的油佐剂，粘稠且稳定性差，毒副作用严重，一般只用于实验研究，难以用于制备疫苗8。后来人们发现可以通过乳化，降低油乳佐剂中油的成分，现在油乳佐剂中油的含量已经只有5%左右。此外人们还发现，使用一些可以代谢的油类，如花生油、角鲨烯等，来取代矿物油，可以制备更加安全、稳定、有效的油乳佐剂9, 10。最常见的油乳佐剂是弗氏佐剂，分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。弗氏不完全佐剂是由引力和粘度较低的矿物油（白油）及乳化剂混合制成的贮藏性佐剂。弗氏完全佐剂则是在弗氏不完全佐剂的基础上添加分枝杆菌。由于分枝杆菌来源有限，且存在较强的副作用，所以工业化的疫苗生产中一般较少使用。目前我国弗氏不完全佐剂主要是使用矿物油（白油）和乳化剂配制而成。白油，别名液体石蜡，是将石油原油经过特殊的深度精制以后的矿物油。通常我们按照白油在40的运动粘度来划分白油的牌号，表一为常见的白油型号。表1-1 常见白油型号项目5#7#10#15#运动粘度（40）m2/s466.17.591113.516.5闪点（开口），不低于130135140160倾点，不高于-5-5-5-10颜色，不低于赛氏号+30+30+30+30腐蚀试验（级）100 3h1111外观水白色水白色水白色水白色油乳佐剂可以提高免疫后抗体的滴度并且延长其保护期。J. Aucouturier对其作用机制进行了相关的研究，并提出以下几种解释：第一，油乳佐剂可以将特异性抗原包裹起来，避免其被体液中的各种酶分解，降低抗原分解的速度同时延缓抗原释放，刺激机体产生连续的特异性免疫应答。第二，油乳佐剂本身可以刺激局部产生炎症反应，刺激炎性细胞增殖，从而增强机体的体液免疫和细胞免疫应答。第三，油乳佐剂可以将注射部位的特异性抗原经淋巴系统转运至全身的淋巴结和脾脏，从而增加机体的免疫应答11。油乳佐剂的活性受其黏度、乳状液类型、乳化剂稳定性等的影响。油乳佐剂的黏度太大会影响乳滴的表面活性剂的结构，造成佐剂活性降低。水包油（O/W）型乳状液安全性较高，但扩散快，使得佐剂活性较低；油包水（W/O）型乳状液能在注射部位贮存时间较长，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作用，佐剂活性很高；双相型（W/O/W）乳状液的作用时间和活性都介于两者之间，但稳定性较差，容易转化为W/O型。油乳佐剂最大的缺陷就是副反应严重，皮下注射极易导致肌肉肿胀，影响动物的的采食饮水，黏度较大的油乳佐剂还会导致局部组织坏死，瘤样增生，关节炎等不良反应。这些不良反应都会导致被免疫动物应激，免疫力降低，影响免疫效果。由于矿物油在体内不能被代谢，在机体内可能诱发自身免疫，容易引起自身组织损伤或内脏病变等病症12, 13。鉴于矿物油的毒副作用较大，人们尝试用一些非矿物油，如花生油、角鲨烷、角鲨烯等可代谢物质来代替矿物油。目前，常见的矿物油佐剂除弗氏佐剂外还有摆有白油司本佐剂，ISA206等。非矿物油佐剂有MF-59，SAF系列等。1.2.3 细胞因子类佐剂细胞因子类佐剂是一种尚处于实验研究阶段的佐剂，免疫系统受到抗原刺激以后，会分泌一类具有免疫调节作用的小分子蛋白质，称为细胞因子，这类小分子蛋白质已经被证实具有良好的免疫佐剂性能。相较于其他免疫佐剂，细胞因子类的免疫佐剂的优势是安全性高，用量低，能确实有效地增强机体的特异性免疫应答。Starach和wood发现，用牛血清蛋白免疫小鼠后追加IL-1，在第二次免疫时抗体水平可提高五十多倍14。此后，关于细胞因子类佐剂的研究越来越多15-17。细胞因子类佐剂主要有白细胞介素，干扰素，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。其中，白细胞介素类细胞因子作为免疫佐剂能增强Th1型细胞免疫应答，IL-4和IL-10能增强Th2型细胞免疫应答。IL-2可以同时增强机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，应用较为广泛18；干扰素在兽医临床上应用也较为广泛，IFN-能促进抗原提呈细胞表面MHC类分子的表达，诱导T细胞分化为Th1细胞，增加CTL免疫应答反应，提高IgG抗体水平；集落刺激因子类佐剂可以促进抗原递呈细胞的分化和成熟，促进膜表面MHC类分子和B7共刺激因子的表达，促进抗原递呈，从而加强免疫应答19, 20。细胞因子类佐剂在使用时可以使用其蛋白直接注射，也可以用人工构建的表达该细胞因子的重组质粒进行免疫。目前，将细胞因子类佐剂配合核酸疫苗进行免疫的研究较多，很多研究显示细胞因子类佐剂可以有效地解决核酸疫苗免疫原性差的问题。1.2.4. 天然来源佐剂天然来源佐剂主要是多糖和皂苷，即利用一些从植物中药或真菌中提取的具有生物活性的多糖和皂苷佐剂制备的佐剂。多糖作为佐剂的特点是天然、低毒、可代谢，安全性高。常见的植物多糖佐剂有黄氏多糖，当归多糖、板蓝根多糖、茯苓多糖、枸杞多糖、板蓝根多糖、香菇多糖和淫羊藿多糖等。此外还有一些从细菌真菌中提取的多糖，如细菌脂多糖，酵母多糖，马尾藻多糖等21。同时，有一些研究尝试对多糖进行硫酸化修饰以提高其活性，如硫酸化黄氏多糖，硫酸化香菇多糖等22。多糖类佐剂具体的作用机制尚未明确，可以肯定得是多糖可以对机体的免疫系统发挥多种调节作用，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞，促进T细胞和B细胞的分化，活化补体，促进IL-2、IL-6等细胞因子的生成23, 24。也有研究表明，多糖佐剂的免疫增强作用与机体的神经内分泌系统有关25。淫羊藿多糖可以促进老年大鼠下丘脑和皮质-内啡肽的分泌，并显著提高NK细胞活性26。革兰氏阴性菌的细胞壁内含有的脂多糖，同样具有免疫调节作用，可以促进IL-1等细胞因子的分泌，增强吞噬细胞的抗原递呈能力，对于细胞免疫应答和体液免疫应答均有增强作用。皂苷是一类由30个碳原子组成的三萜化合物，可以游离存在或者与糖结合成苷。三萜类化合物具有广泛的生物学活性，抗炎，抗菌，抗病毒。植物中药中含有的皂苷普遍具有免疫调节与促进作用，可以制备成佐剂使用。Quil-A是从南美皂树树皮中提取的天然植物皂苷，可以引起强烈的免疫应答，被当做铝佐剂的替代物，但其毒副作用较强，可引起肉芽肿，溶血等不良反应。QS-21是从Quil-A中提取的复合糖脂，毒性相对较低，能诱导由CD4+Th1细胞和细CD8+胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答27。其他植物中药皂苷，如人参皂苷Rh2，可以促进白蛋白、球蛋白的合成，抑制肿瘤细胞增殖，增强T淋巴细胞和巨噬细胞活性28。此外，天然来源佐剂还有-半乳糖神经酰胺，蜂胶等。-半乳糖神经酰胺提取自海洋海绵体，可以稳定NK细胞，进而促进各种细胞因子的分泌29。蜂胶可以激活红细胞膜上的Cab受体，增强红细胞的免疫功能，激活与保护中枢免疫器官，刺激多种细胞因子的分泌30。以蜂胶作为的佐剂的禽霍乱疫苗已经在国内开始广泛推广。1.2.5其他类型佐剂除上述几类佐剂以外，目前国内外文献中提到的佐剂种类还有很多，这些佐剂通过促进细胞因子的分泌，或者增加抗原递呈过程，激活淋巴细胞等方式增强机体的特异性免疫应答，这里重点介绍以下几种佐剂。脂质体佐剂，由脂质双分子层组成的，内部为水相的闭合囊泡颗粒，可分为单层脂质体，多层脂质体和多囊脂脂质体。1974年，Allison发现在用白喉类毒素进行免疫时，将脂质体作为佐剂可以显著增强免疫应答，首次证明了脂质体具有免疫佐剂效应31。脂质体可以将抗原包裹起来，引导抗原进入细胞内，沉积于肝、脾、淋巴结等处。从而延长了抗原在体内的停留时间。目前，用作疫苗佐剂的脂质体主要由磷脂，胆固醇和类脂A组成。Mann等发现，颗粒直径较大的脂质体颗粒容易被树突状细胞摄取，可刺激机体产生高水平的IFN-和IgG，增强由Th1细胞介导的细胞免疫应答。而直径较小的脂质体颗粒则向淋巴转运，诱导产生较强的CD8+T细胞免疫应答和Th2细胞免疫应答，增强体液免疫应答，产生高水平的抗体32。此外，阳离子脂质体本身具有佐剂效应，可以促进树突状细胞等抗原递呈细胞的成熟，增强其抗原递呈能力，诱导一些炎性因子的释放，从而增强细胞免疫应答。惰性纳米球，即直径为小于1um的惰性固体纳米球，可以吸附抗原，增强抗原递呈细胞递呈抗原的能力，诱导产生CD8+T细胞免疫应答。纳米球颗粒还可以提高IFN-的分泌水平，从而增强体液免疫应答的细胞免疫应答33。核酸佐剂，最为典型的是CpG佐剂和PolyI:C佐剂，CpG佐剂是含有未甲基化的CpG基序的寡聚核苷酸，经内吞作用进入细胞后与TLR9相互作用，激活多种免疫细胞，诱导产生多种细胞因子和强烈的Th1型免疫应答，增强CD8+T细胞免疫应答34。Poly:C是人工合成的双股RNA类似物，通过模拟病毒感染诱导机体产生免疫应答。Poly:C是TLR的配体，特异性结合后可激活黏膜免疫反应，诱导机体产生细胞免疫应答35。多肽佐剂，常见得有胞壁酰二肽、三肽囊素、胸腺肽等。胞壁酰二肽类佐剂是指胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物36。胞壁酰二肽是分枝杆菌细胞壁的组成成分。作为佐剂，胞壁酰二肽可以增强机体的特异性免疫应答反应，还能增强健康的或者免疫缺陷的动物对于肺炎杆菌，大肠杆菌等多种病原的非特异性免疫反应。三肽囊素是从鸡法氏囊中分离出的一种三肽，其氨基酸序列为Lys-His-Gly，是目前从法氏囊中分离出的唯一具有生物活性的分子37，对禽类具有免疫调节作用，可以促进免疫器官的发育和B淋巴细胞的分化38。此外，还有一些人工合成的小分子药物，如咪喹莫特类药物，也具有免疫调节作用。咪喹莫特及其类似物可以提高IL-6，IFN-，TNF-等细胞因子的分泌水平，增加B淋巴细胞的抗原特异性反应39。1.3 流感病毒的抗原表位研究进展1.3.1 流感病毒的结构A型流感病毒属于正黏病毒科，正黏病毒属，单股RNA病毒。病毒粒子一般为球形，表面有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两种纤突，HA和NA是禽流感病毒表面的主要糖蛋白，在病毒感染过程中起着重要作用，具有亚型的特异性和多变性。流感病毒极易发生突变，其中编码HA和NA的基因突变率最高，而且不同的HA和NA之间可发生组合，构成各种亚型。根据HA和NA抗原结构的差异，目前已经确定了16个HA亚型和9个NA亚型。流感病毒的RNA共编码十种蛋白，除了位于病毒粒子表面的HA蛋白和NA蛋白以外，还有三个聚合酶蛋白，PA、PB1和PB2；两个非结构蛋白，NS1和NS；两个基质蛋白，M1和M2；一个核蛋白，NP40。相对于位于病毒粒子表面的HA蛋白和NA蛋白，这八种蛋白比较保守。免疫表位数据库中记录的各类宿主的流感病毒抗原表位共3807个，其中HA蛋白上有1525个，NA蛋白上有309个，位于NP蛋白上的有501个，位于M1蛋白上的有275个，位于M2蛋白上的97个，位于NS1蛋白上的有109个，其他的则位于与病毒RNA复制相关的各类聚合酶复合体上。1.3.2 抗原表位的筛选方法抗原表位，又称抗原决定簇，决定了病原的特异性。病毒等病原进入机体后，经过抗原递呈细胞递呈处理以后，抗原表位会被递呈到细胞表面，并与MHC分子结合，结合后的抗原表位可以被机体的T细胞识别，诱导产生T细胞免疫应答。B细胞对抗原的识别不收MHC分子的限制，可以直接识别经过免疫细胞处理的抗原表位，激发体液免疫应答。对于流感病毒入侵机体后引起的免疫反应，除了可以一直流感病毒侵入细胞的中和抗体以外，越来越多的研究发先，CD4+T细胞免疫应答对于机体感染流感病毒后的恢复尤为重要。CD4+T细胞除了能辅助体液免疫应答以外，也能促进CD8+T细胞介导的细胞杀伤作用。因此，关于CD4+T细胞表位的研究越来越多。此外，有研究发现有些CD8+T细胞表位同样可以引起机体产生CD4+T细胞免疫反应，即CD4+T细胞抗原表位和CD8+T细胞存在的同源性41。目前，对于B细胞表位的筛选主要是利用包含病毒蛋白全序列的多肽库免疫动物，制备单克隆抗体后，采用ELISA等方法，判断得到的单克隆抗体是否能和全病毒抗原反应，或是进行动物保护试验判断利用多肽进行免疫产生的抗体在攻毒后能否给与被免疫动物有效的保护。对于T细胞表位的筛选，则主要是通过免疫接种或细胞培养的方式获得特异性的T淋巴细胞系，之后用多肽库刺激T淋巴细胞，采用Elipot或是细胞内因子染色等方法，通过IFN-的细胞因子的水平来判断该肽段是否存在T细胞抗原表位。此外，对于初步确定的抗原表位，进行免疫信息学的相关分析也是确定抗原表位的重要方法，一般来说，抗原表位的氨基酸序列高度保守。1.3.3 聚合酶蛋白抗原表位流感病毒的聚合酶蛋白共有三种，PA蛋白，PB1蛋白和PB2蛋白。这三种蛋白组成一种多功能复合体，负责流感病毒RNA复制，mRNA转录以及病毒生命周期的维持。该蛋白复合体高度保守，结构稳定。Ochoa制备了13株PA蛋白的单克隆抗体，8株PB2蛋白的单克隆抗体，采用阻断ELISA的方式来确定其抗原表位的位置。结果在PA蛋白中确定了5个存在抗原表位的互不重叠的区域，集中在PA蛋白开头的236个氨基酸和末端的157个氨基酸区域内。在PB2蛋白上共确定了3个可能存在抗原表位的互不重叠的区域，位于PB2蛋白的1-113氨基酸区域内42。Manpreet采用软件预测和动物实验的方法，确定了PA蛋白在626-676位氨基酸区域内存在抗原表位43。Tourdot等则确定了PB1蛋白在349-357个氨基酸区域内的抗原表位44。1.3.4 HA蛋白抗原表位HA蛋白位于流感病毒粒子的表面，是中和抗体作用的主要目标，对禽流感病毒免疫原性有着决定性影响。针对HA蛋白抗原表位的研究很多，HA蛋白上即有B细胞抗原表位，又有T细胞抗原表位45。免疫表位数据库中记录的抗原表位中，位于HA蛋白上的抗原表位有1525中，其中B细胞表位有565个，CD4+T细胞表位530个，CD8+T细胞表位70个。Muller等用固相法人工合成的多肽来代替疫苗免疫小鼠和兔子，结果发现免疫后产生的抗体与可以流感病毒发生交叉反应，同时抗体可以抑制流感病毒的血凝现象，由此确定了HA蛋白的91-108位氨基酸存在B细胞抗原表位46。此后Tamar用91-108位氨基酸免疫小鼠，产生了强烈的黏膜免疫反应和高水平的抗体，可以抵抗致死量的流感病毒接种47。Venkata等采用软件预测的方法，预测了HA蛋白上的4个T细胞表位，YHANNSTD(7-15)、VTVTHSVNL(24-32)、LREQLSSVS(101-109)和LSSVSSFER(105-113)，之后通过与1997-2009年间流行的H1N1毒株进行对比，证明这些区域的氨基酸其高度保守（88.8%-100.0%）48。1.3.5 NA蛋白抗原表位NP蛋白是流感病毒例子表面的另一种糖蛋白，可以组织HA蛋白和唾液酸受体的结合，从而抑制病毒进入细胞。目前，文献中已经报道的抗原表位，NA蛋白上B细胞表位17个，CD8+T细胞表位15个以及CD4+T细胞表位123个49。Lijun等人工合成了H3N2流感病毒NA蛋白的三个保守肽段，ES8，RR9和WK7，分别为NA蛋白氨基酸序列的第221-228位，292-300位和383-389位，并用这三个短肽免疫新西兰兔。结果显示，这三种多肽都能诱导新西兰兔产生特异性抗体，用ELISA法验证，这些抗体可以和H3N2病毒特异性结合。可以推断，这三个短肽是H3N2流感病毒的B细胞表位50。Jenny等人工合成包含了HA蛋白（H1,H3和H5）和NA蛋白（人和鸟类的N1和N2）全部序列的肽段，采集健康成人的外周血液单个核细胞，采用Elispot的方法，检测这些肽段能够刺激T细胞分泌IFN-，以确定T细胞抗原表位的位置。结果发现NA蛋白上存在大量的CD4+T细胞表位51。1.3.6 NP蛋白抗原表位NP蛋白高度保守，与PB2蛋白之间相互作用，对于流感病毒的核糖核蛋白复合物（vRNA）的合成十分重要。Gui等将NP蛋白第88为的天冬氨酸突变成丙氨酸以后，感染MDCK细胞，采用免疫印迹验证NP蛋白与PB2蛋白之间的相互作用，结果显示第88位的天冬氨酸对于NP蛋白与PB2蛋白之间的相互作用尤为重要52。关于NP蛋白上的抗原表位，免疫表位数据库中记录的3807个抗原表位中有507个在NP蛋白上，其中确定为B细胞表位有24个，CD8+T细胞表位171个，CD4+T细胞表位178个。Li Chen等通过细胞内因子染色的方法，检测流感病毒NA蛋白上是否存在T细胞抗原表位。结果确定了十个抗原表位可以刺激T细胞分泌IFN-，证明了NA蛋白上的确存在CD4+T细胞抗原表位53。1.3.7 M蛋白抗原表位和NS蛋白抗原表位M1蛋白和M2蛋白是组成禽流感病毒的两种结构蛋白，其中M1蛋白是一种基质蛋白，M2蛋白是一种膜蛋白。很多研究认为流感病毒T细胞多位于HA蛋白和M1蛋白53。免疫表位数据库中记录的抗原表位中，位于M1蛋白上的CD4+T细胞表位120个,CD8+T细胞表位52个，而B细胞表位只有16个。NS1蛋白和NS2蛋白是禽流感病毒的两个非结构蛋白，对于非结构蛋白抗原表位的分析，十分具有临床意义，可以针对其抗原表位作出通用性探针，有利于对流感病毒的防控和诊断。Carolien等用2013年中国流行的H7N9毒株（A/Anhui/1/2013）与sH3N2、sH1N1和pH1N1毒株特异性克隆扩增的人源CD8+T细胞，采用Elispot的方法检测H7N9能否刺激T细胞分泌IFN-。结果发现，H7N9与上述三个毒株之间存在一定程度交叉的CD8+T细胞免疫应答，但是研究中所采用的NS1蛋白的三个抗原表位，NS1112-132、NS1122-130和NS1158-166未能诱导产生明显的CD8+T细胞免疫应答54。1.3.8 禽流感病毒的抗原表位研究现状禽流感（Avian influenza, AI）是由A型流感病毒引起的，发生于各种家禽和鸟类的一种急性传染病。禽流感是我国法定的畜禽一类传染病，根据其对禽类的致病性，禽流感又可以分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。其中，高致病性禽流感致病性强，患病家禽死亡率，对养禽业危害极大。高致病性的禽流感毒株主要是含H5和H7的亚型。免疫表位数据库中记录的，宿主为鸡的流感病毒抗原表位有31个，其中位于HA蛋白上的有10个，位于NP蛋白上的有14个，位于M1蛋白上的有5个，位于M2蛋白上的有2个。其中，CD8+T细胞表位共有20个，主要位于NP蛋白（14个）和M1蛋白上（5个）。CD4+T细胞表位只有1个，位于HA蛋白上。B细胞表位有9个，位于HA蛋白（7个）和M2蛋白上(2个)。可见对于禽流感病毒抗原表位的研究，相对来说比较少。1.4 多肽合成方法1.4.1 多肽合成技术发展概述随着对于多肽活性物质功能的研究越来越多，人们对于多肽的认识也越来越深。多肽类药物以及多肽疫苗等也相继问世。因此，如何能以合适的成本规模化生产多肽成为多肽类制品发展需要解决的问题。早多肽合成技术发展的早起阶段，多肽的合成一般都是在液相中进行的。时至今日，液相合成法也是较为经典的多肽合成方法，大多数多肽类生物制品仍然是采用液相法合成的。后来，Merrifield又创立了固相合成法，使用树脂等固相载体合成多肽，这是多肽合成技术发展过程中的一大突破。在传统液相合成法和固相合成法的基础上，又相继出现了液相分段合成法和氨基酸羧内酸酐法等多肽合成方法，这些方法都有着各自的优势。此外，随着生物技术地飞速发展，酵母法和酶解法等多肽合成技术越来越成熟。利用DNA重组技术合成多肽也成为多肽合成技术的研究方向。1.4.2 液相合成法液相合成法优于在合成过程中可以对合成中间体进行纯化，因为其产物的纯度较高，这也是液相合成法最大的优势。液相合成法的缺点则是其合成过程较为繁琐，合成周期长。早期的液相合成法多应用于一些小分子蛋白的合成，Yajima和Fujii采用液相合成法制备了核糖核酸酶的晶体，该晶体由124个氨基酸组成55。在此之后，Sakakibara等开始研究采用液相合成法制备含100个以上氨基酸多肽的通用制备方法，他将整个目标分子用10个氨基酸左右的片段组成而成。微波辐射也被应用到了液相法多肽合成技术当中，大大提高了液相合成法的效率。Barreto等将微博辅助和UGI反应法合成了多种N-取代甘氨酸类多肽，此方法增强了多肽合成的多样性56。Tantry等采用微波辐射结合液相合成法，合成了五肽片段，产物纯度高达90%，每步缩合反应仅需40秒左右57。关于长肽段的合成，人们又研究出来液相分段合成法，即利用多肽片段的化学专一性和化学选择性，让其在溶液中自发连接成长肽，但此项技术还不够完善。1.4.3 固相合成法固相合成法相较于液相合成法，由于不需要对中间体进行分离和纯化，因而合成过程被大大简化了。但随之而来的问题是，固相合成法直接合成的多肽序列较短，合成的效率较低，所需时间较长。此外，固相合成法中所用的试剂毒性较大，树脂成本较高，这些也都限制了商业化多肽类生物制品中固相合成法的应用。固相合成法又可以分为Boc固相合成法和Fmoc固相合成法，分别以Boc-和Fmoc-为保护基，保护-氨基酸。Fmoc固相合成法在脱保护基以及从树脂上切除产物时条件较为温和，而且副反应比Boc固相合成法少，因而应用也更为广泛。固相合成法合成长肽段的思路是先以固相法合成各个小片段肽段，再通过液相法把各个片段连接起来。Albericio通过这种方法合成的多肽，纯化后产率可以达到65%左右，说明这种将固相法和液相法相结合的多肽合成方法是可行的58。固相合成法中常用的树脂有很多种，根据其与氨基酸的连接方式可以分为三类。以酯键的形式与氨基酸相连，如Wang 树脂；以酰胺键的形式与氨基酸相连，如MBHA树脂和Knorr树脂；以醇键的形式与氨基酸相连，如氯树脂。由于树脂都较为昂贵，所以如何选择合适的连接基团和反应条件，使树脂可以重复使用是降低固相合成法的主要措施。也有研究发现，微波辐射切割后的树脂，可在一定程度上恢复其担载量。1.4.4 生物化学合成法除了上述化学合成的方法以外，采用生物化学的方法合成多肽的技术也在不断完善中。与化学合成法相比，生物化学合成多肽的优势是区域选择性和立体选择性，不必考虑在合成过程中对于氨基酸各官能团的保护。生物化学方合成法主要有酶解法和基因工程法。酶解法是利用生物酶将大分子的动物蛋白或者植物蛋白降解，得到一些小分子的生物活性肽。其优点是可以保证蛋白的天然性，不会掺杂一些其他化学物质。但是由于酶解后得到的是一系列多肽，所以分离纯化难度较大，一般不用于制备单一多肽。此外，由于酶的催化作用具有一定的特异性，这也限制了酶解法的应用。基因工程法是利用利用基因重组技术，即构建可以表达多肽蛋白的质粒，再将其转化到大肠杆菌等生物工程菌种进行表达。其优点是成本低，产量高，质量稳定，可以保证多肽的天然活性。但基因工程法也存在着如何高效表达，分离困难等难题，无法应用于规模化生产。1.5 研究目的与意义本实验采用禽流感病毒的T细胞表位多肽作为佐剂，以增强禽流感灭活疫苗后的免疫保护作用。这种增强作用可以使在生产实践中免疫禽流感灭活疫苗时降低抗原的使用量，从而节省免疫接种的成本。此外，T细胞表位能够刺激机体产生细胞免疫应答，从而使被免疫动物能够产生更加全面的免疫应答体系，提升禽流感疫苗的免疫保护作用。第二章 T细胞表位多肽的合成2.1引言 通过查找文献等方法共确定了初步进行试验的PS0804、PS0813、 PS0814、PS0815、PS0816、PS042和PS0524七条多肽，采用Fmoc固相合成法进行合成，纯化去除二甲基亚砜（DMSO），采用高效液相色谱法进行纯度检验。2.2材料2.2.1主要仪器设备多肽合成仪 美国Peptide Scientific Inc. PTI公司产品液相色谱仪 美国waters公司产品液-质联用仪 日本SHIMADZU公司产品酶标仪 美国Bio-Rad公司产品洗板机 美国Bio-Rad公司产品循环式切向过滤膜包 美国PALL公司产品磁力搅拌器旋转蒸发仪砂芯漏斗2.2.2固相多肽合成、裂解、纯化的相关试剂溶液一: N-甲基吡咯烷酮(N-Methyl pyrrolidone,NMP) ，这是多肽合成过程中的主要试剂。溶液二：脱保护剂（deprotectant），一般使用 20%的哌啶 PIP（piperidine）溶液。溶液三：N,N-二异丙基碳二亚胺（N,N-Diisopropylcarbodiimide，DIC）在多肽合成中的接肽一步，在加入保护性氨基酸后加入。溶液四： (Apoptosis Inhibitor of Macrophages, AIM)，在多肽合成中做带帽保护作用。溶液五：苯酚二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF），裂解过程中清洗剂。溶液六：裂解液（三氟乙酸（TFA）/三异丙基硅烷（TIS）/苯酚/ H2O=85/8/6/1）其作用是将合成的肽链从树脂上切割下来。其它试剂：0.1M的NaOH：取4gNaOH加入纯H2O中，混匀即可；分析纯DMSO、甲醇溶液，北京化学试剂厂产品，4保存O型FMDV标准阳性血清购自兰州兽医研究所，-20保存。RinkAmideMBHAresin树脂，取代值（substitution）为0.34mM/g，粒度在 100200 mesh之间。溶解氨基酸用HOBT/NMP溶液（4.6gHOBT+NMP到100ml）配好的溶液搅拌混匀后，直接配置氨基酸，每1nmol氨基酸用此溶液4ml即可。2.3方法2.3.1多肽的合成程序1、多肽抗原化学合成：使用PSI全自动多肽合成仪，采用NMP溶剂体系，利用固相合成法制备。整个抗原的生产过程分为树脂溶胀反应（图2-1）、脱Fmoc保护基反应（图2-2）、缩合反应（图2-3）和乙酰化戴帽（图2-4）反应四部分。2、计算机控制程序的设定：将多肽抗原的氨基酸序列及合成所需要的步骤依次输入计算机内，编成程序。3、氨基酸活化酯的生成：将待合成的氨基酸与1-羟基苯丙三唑（HOBT）反应合成得到活泼的氨基酸-HOBT酯。4、脱Fmoc保护基反应：用20%哌啶（PIP）的 N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液与肽链氨基上Fmoc保护基团反应2次，每次15min，以除去Fmoc保护基。然后用N-甲基吡咯烷酮（NMP）和甲醇清洗，除去残余的哌啶。5、缩合反应：启动计算机控制的合成程序，使合成仪器自动将各种活化的氨基酸和DIC（二异丙基碳二亚胺）加至反应器中。缩合过程由C端至N端，依照设定的序列不断的重复。反应完成后，用NMP清洗，以除去残余的氨基酸。6、乙酰化戴帽反应：加入2%乙酰咪唑，对游离的氨基进行乙酰化处理，终止多余的肽链生成。用NMP清洗，除去剩余的乙酰咪唑。根据序列依次加入目的氨基酸，并按照树脂溶胀反应、脱Fmoc保护基反应、缩合反应和乙酰化戴帽反应继续合成，直至获得目的多肽。表2-1：多肽合成树脂溶胀标准程序Table 2-1: Standard expand procedure of synthetic peptide resinaSTEPFUNCIIONVOLUMESPARAMETERREPEAT1NMP wash100:01:3022Add NMP1N/A13Mix100:40:0014Wait100:40:0015Mix100:40:0016Wait100:40:0017Empty100:00:401表2-2：标准多肽合成的脱保护程序Table 2-2: Standard deprotection procedure of synthetic peptideSTEPFUNCIIONVOLUMESPARAMETERREPEAT1Add 25PIP1N/A12Mix100:15:0013Empty100:00:451续表2-2STEPFUNCIIONVOLUMESPARAMETERREPEAT4NMP wash100:01:3025Add 25PIP1N/A16Mix100: