毕业论文——DC系列N—芳苄基取代甲川染料的合成

齐齐哈尔大学毕业设计（论文）题 目 DC系列N芳苄基取代甲川染料的合成 学 院 化学与化学工程学院 专业班级 学生姓名 指导教师 成 绩 年 月 日齐齐哈尔大学毕业设计（论文）摘要以对肼基苯磺酸和3甲基2丁酮为原料在冰醋酸催化条件下合成了2,3,3三甲基3H吲哚5磺酸。并用其制得钾盐，再用不同的N烷基化试剂与其进行反应，获得了一系列不同N烷基取代的吲哚季铵盐。将N对羧苄基取代的2,3,3三甲基3H吲哚5磺酸季铵盐，N对甲苄基取代的2,3,3三甲基3H吲哚5磺酸季铵盐分别与原甲酸三乙酯反应，合成水溶性不对称三甲川菁染料。优化了中间体的合成过程和条件。为了与C-18反相柱进行比较，采用正相硅胶柱层析法进行分离研究，考察了展开剂的组成配比对分离效果的影响。最后利用核磁共振氢谱对所合成的化合物进行结构表征。对合成的染料进行光学性能测试。关键词：合成；水溶性；菁染料Abstract 2,3,3trimethyl3Hindoleninium5sulfuric acid was synthesized using phenyl hydrazine sulfonic acid and 3methyl2butanone in acidic medium. 2,3,3trimethyl3H indoleninium5sulfonate was synthesized using it. A series of Nalkyl2,3,3trimethyl3H indoleninium5sulfonates were synthesized involving nucleophilic reaction of 2,3,3trimethyl3Hindoleninium5sulfonate with different reagents for Nalkylation. Title watersoluble cyanine dye Cy3 were synthesized involving condensation reaction of triethyl orthoformate with two quaternary ammoniums of Npcarboxylbenzyl substituted 2,3,3trimethyl3Hindole5sulfonate ammonium salt or Npmethylbenzyl substituted 2,3,3trimethyl3Hindole5sulfonate ammonium salt. The synthetic process and the intermediate conditions of optimization. In order to compare with C-18 reversed-phase column, using normal phase silica gel column chromatography for separation of the expansion, composition ratio agentinfluence on the separation effect. Finally, by using 1H NMR characterization of the synthesized compounds. Optical properties of synthetic dyes.Key words: Synthesis；Watersoluble；Cyanine Dye目 录摘要IAbstractII第章绪论1 1.1菁染料介绍1 1.1.1菁染料的结构和分类1 1.1.2菁染料的合成4 1.2菁染料的光谱性能11 1.2.1菁染料分子吸收光谱11 1.2.2菁染料分子荧光光谱12 1.2.3菁染料的聚集13 1.3菁染料的分离、提纯13 1.4选题背景和依据13第 2 章实验部分15 2.1实验试剂及仪器15 2.2中间体合成路线16 2.2.1水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的制备16 2.2.2水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾盐的合成16 2.2.3水溶性中间体吲哚钾盐的N烷基化17 2.2.4水溶性吲哚三甲川菁染料的合成17 2.3中间体的合成18 2.3.12,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的合成反应温度优化18 2.3.22,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾的合成方案优化18 2.3.3水溶性中间体吲哚钾盐的N烷基化19 2.3.4水溶性直链三甲川菁染料的合成19 2.4目标染料的分离纯化20 2.4.1C-18反相柱层析法20 2.4.2湿法硅胶柱层析法20 2.4.3正向硅胶柱层析法溶剂的去除21 2.4.4正向硅胶的再生22 2.5染料结构表征22 2.6紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱的测试22 2.7目标染料在不同pH水溶液中的光谱性能测试22第3章 结果与讨论23 3.1染料中间体的合成及优化23 3.1.12,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的合成反应温度优化23 3.1.22,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐的合成方案优化23 3.1.3水溶性中间体吲哚钾盐的N 烷基化24 3.2目标产物的合成及Cy3b-1的合成方案优化24 3.3目标产物的分离及表征26 3.3.1C-18反相柱层析法26 3.3.2湿法硅胶柱层析法中不同展开剂对水溶性菁染料分离的影响27 3.3.3核磁共振定性分析28 3.4Cy3b-1的紫外-可见吸收及荧光发射光谱28 3.5Cy3b-1在不同pH水溶液中的紫外-可见吸收及荧光发射光谱30结论32参考文献33附录1正相硅胶柱层析分离得到产品的核磁共振谱图37致谢38IV第章绪论在蛋白质标记领域，荧光标示技术以其检测的高灵敏度和精确度将替代同位素标记这一传统方法成为科学家们的研究热点。随着生物技术研究和生命科学领域的飞速发展，荧光分析技术水平得到了快速提升，其在基因测序、基因表达及临床诊断等方面的应用更促进了生物科学的进步，推动了技术的逐渐攀升。吲哚菁染料因其具有良好的光谱性能、突出的水溶性和较高的光稳定性、最大吸收波长可调协范围大（3001800 nm）、分辨率高1、灵敏度好、结果清晰准确、操作简便安全等优点而表现得极为突出。由于该染料在与一些生物分子进行结合后能够释放出荧光2，因此吲哚菁染料作为一种荧光探针被广泛地用于生物分析领域3，成为了现代生物检测的一项重要手段。其中以罗丹明类、荧光素类和菁类为主，这些染料的光谱范围主要分布在紫外可见区，而生物样品在本区域内同样具有很强的吸收效能，进行荧光检测时会产生很强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。相比之下，近红外荧光染料以组织穿透性好和荧光背景低等显著优势而一直被当作很好的生物荧光探针，应用于生物体内的各项研究中4，近年来更受到了广泛的关注。1.1菁染料介绍菁染料由威廉姆斯发现，其最初作用是用于扩大卤化银的感光范围，从而提高感光能力。但由于菁染料能与诸如蛋白质、核酸等生物分子相互作用，并引起光谱强度值的改变和整体移动，因而这类染料在生物领域应用极为广泛。由于吸收及发射波长较长，光波能量低，在分析检测活体生物分子时的伤害小5,6,7，使其成为这类染料在应用中的另一重要优势。作为一种有机大分子染料，专家们还在进一步将它大规模地应用在复印件的光感受器、光盘的记录介质、电子摄影术、光动力治疗、太阳能电池光敏剂、激光材料和生物分子探针等方面8-14。而作为可调吸收和发射光谱范围的菁染料也将会成为一种前途光明的近红外荧光标示剂，应用在蛋白质、氨基酸及胺类化合物的化学衍生化分离检测中。1.1.1菁染料的结构和分类多甲川染料是指发色团共轭体系两端建立在杂原子之间的脒离子插烯物，其共轭体系中通常含有一个或几个次甲基链，甲基链两端连有类似苯并噻唑、吲哚啉等杂环。如果有多个甲川链来连接2个含有杂原子的杂环核的基团，则被称为菁染料，包含在菁染料中心的两个杂原子，通过共轭甲川链连接，这样就组成了共轭烯烃骨架结构的推拉电子形式。在此结构中，共轭链上含有奇数个碳原子。菁染料分子具有可修饰性和共轭烯烃链独特的结构特点。它的基本结构可用图1-1中的极限式杂化共振体表示：图1-1 极限式杂化共振体按照不一致的所含杂环核菁染料的类型，可分为咪碳菁、硫碳菁和氧碳菁等，其中，每个类型都可以分的更详细、更精确，例如含氮的碳菁染料也可能是噻唑、喹啉、咪唑、吲哚或者相应的苯并等体系，如果根据共轭甲川链上刚性环结构的差异区分，还分为方酸菁、克酮酸菁等。由于在菁染料的母体里共轭亚甲基链单元中有电荷的存在，正是根据这一特点，可将染料分为以下几种15，如图1-2所示：（1）阳离子亚甲基链菁型、半菁型染料，（2）阴离子亚甲基链型染料，（3）中性亚甲基链份菁染料，（4）两性离子方酸菁染料。若2个杂原子都是氮，则为含氮阳离子菁染料（1）；若2个杂原子都是氧，则为含氧的阴离子鎓菁染料（2）；若其中一个为氮，另一个为氧，则为中性的份菁染料（3）；若甲川链上引入方酸环结构，则为两性离子型方酸菁染料（4）。 图1-2 菁染料的骨架结构含氮阳离子菁染料就是我们常说的菁染料。菁染料分子可含有吡啶、噻唑、喹啉、吡咯、吲哚等各种杂环，其中苯并噻唑、喹啉、吲哚啉杂环最为常用。通常情况下，作为一种全反式结构的稳定存在，菁染料在一些特定的条件下也会产生光致异构化，从而获得某些顺式的构型。菁染料的一般结构见图1-3，吲哚菁染料的一般结构见图1-4。 图1-3 菁染料的结构通式 图1-4 吲哚菁染料的结构菁染料通常包括甲川基、杂环、成盐烷基和阴离子。根据杂环性质以及N原子上取代基性质，可分为3种结构类型16：第一种，碳菁，又可分为对称菁和不对称菁两种。例如：对称菁：阳离子桃红FF 不对称菁：阳离子橙2GL第二种，氮杂菁，碳菁分子甲川链上次甲基被氮原子取代，则为氮杂菁。例如：阳离子猩红第三种，半菁，半菁中多次甲基链相连氮原子只有一端为杂环，另一端为芳香稠环或苯环。例如：阳离子黄X-6G半菁的颜色以黄色为主，一般的半菁耐光牢度较差，而一些具有特殊结构的半菁有较好的耐光牢度。苯乙烯菁，大多为鲜艳的红色，耐光牢度比一般半菁稍高。苯乙烯菁的甲川链一端与含氮杂环相连另一端连接苯环。例如：阳离子艳红5GN偶氮型二氮杂半菁，大多为黄、红、蓝色，耐光牢度大大提高。苯乙烯菁中次甲基被N取代，且分子中带有离域正电荷。例如：阳离子艳蓝RL1.1.2菁染料的合成在威廉姆斯得到“豆粉蓝”菁染料后，大量结构不同的菁染料先后被报道。通过缩合剂和杂环化合物的甲基反应合成了近红外吸收功能菁染料。从整体来看，合成菁染料可以使用一步法、两步法或者固相法。作为一种典型的近红外吸收功能的菁染料，它是通过亲核试剂和缩合剂一步作用直接获得的，这种方法不但操作起来简单，相对容易完成，它的产率也相对较高。Daihi Oushiki等将两种对过氧化物敏感性不同的吲哚菁染料通过对二环己烷相连，设计合成了近红外染料FOSCY-1。该双菁染料带有荧光团与淬灭团，自身没有荧光，但遇到氧化物时淬灭团分解，染料发出强烈荧光,适用于生物荧光分析检测17。合成线路见图1-5。Todor Deligeorgiev等人设计合成了SOSO-1和TOTO-1-6C两系列双菁染料18，染料在蒸馏水和TE三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中均没有荧光，但与dsDNA结合后发生强烈的荧光。合成路线见图1-6。Valentina Rapozzi19等人合成了具有较大电子共轭的方酸菁染料，合成路线见图1-7 。Tariq Mahmood20等人合成了一系列吖啶类近红外菁染料，并研究了染料水中聚集情况，合成路线见图1-8。图1-5 FOSCY-1的合成路线图1-6 SOSO-1和TOTO-1-6C的合成路线图1-7 较大电子共轭的方酸菁染料的合成路线 图1-8 吖啶类近红外菁染料的合成路线Simon Kuster21等人首先合成方酸半菁，然后与一分子苯并吲哚方酸菁染料在甲苯/喹啉下回流，制得具有大电子体系的新型水溶性方酸菁染料，并将其用于太阳能电池领域，合成路线如图1-9。图1-9 方酸菁染料的合成路线通过使用乙醇作为溶剂， Patonay G同Anatoliy L T等人将醋酸钠当成催化剂合成了一种菁染料，这就是吲哚七甲川菁染料，如图1-10所示22,23。图1-10 中位氯取代吲哚七甲川菁染料的合成路线佩特尼同纳瑞尼安特提出了另一种方法来合成七甲川菁染料。这种方法可以不用添加催化剂，它一般是通过吲哚和二醛缩合剂或者苯并吲哚的衍生物进行反应，在反应过程中产物水与苯可以形成共沸物，之后如果利用分水器去除水份，可以使反应向正方向移动，反应路线如图1-11所示23。图1-11 吲哚七甲川菁染料的合成路线Law K Y等人通过方酸和2种不同的亲核剂缩合，共沸蒸馏脱水条件下，生成1种不对称方酸菁和2种对称方酸菁，其中不对称方酸菁的合成路线如图1-12所示24。图1-12 不对称方酸菁染料的合成路线通过首先合成半菁染料，再与另一种杂环化合物进一步反应，经过这两步可以合成不对称菁染料。虽然与操作较为简单的合成对称菁相比，这种方法操作相对复杂，产率比较低，但是，制备所得的不对称功能菁染料往往表现出更加优异的性能，是当今菁染料研究的新方向。Jun H Y等人用N乙基2,3,3三甲基3H吲哚啉为原料，用乙醇为溶剂，三乙胺为催化剂反应得到半菁产物，然后与另一季铵盐反应合成了相应的不对称吲哚方酸菁染料，其合成路线如图1-13所示25。图1-13 不对称吲哚方酸菁染料的合成路线此外，稳定性较差的对称方酸染料，在偶极溶剂中加热，可与另一分子的亲核试剂交换，生成不对称方酸染料，如图1-14所示，产率约为43%75%26，此方法在菁染料合成中得到了广泛应用。图1-14 不对称方酸染料的合成路线泰特瑞特等人采用两步法合成不对称的吲哚方酸菁染料，即先合成半菁，再用所合成的半菁与另一半的中间体反应，得到目标染料，其合成路线如图1-15所示27。图1-15 不对称吲哚方酸菁染料的两步法合成路线通过改变其它种类染料的某种基团来获取一些近红外吸收菁染料，来增强染料某些方面的性能，这就类似于染料的改性。为了获得较大Stokes位移的染料3和提高染料的光稳定性，宋锋玲等人在染料七甲川键中位中加进了供电基团，合成路线如图1-16所示 28。图1-16 染料3的合成路线在溶液中获得半菁染料后，由含有磺酰氯基团的树脂对其进行捕捉，再进行活化，最后使用杂环碳亲核试剂切断，这样就合成了不对称菁染料，这种方法就是Stephen J M等人使用的固相合成法，反应路线如图1-17所示。这种方法的优点在于它能够很大程度地减少纯化的步骤，有效提高了合成效率，所以说这种固相合成方法是非常值得我们学习与借鉴的29。图1-17 非水溶性不对称菁染料的固相合成通过把固相载体和缩合剂混合，所得中间体与杂环母核缩合30，可以制得带有固相载体的半菁，最后利用杂环碳与之反应切掉载体，合成不对称菁染料，合成路线如图1-18所示。在一种特定的溶液中，带有固相载体的半菁可以被析出，这就使其不必经历复杂的分离步骤就能得到相对纯净的中间体半菁，进而可以提高合成效率。陈秀英等人在彭孝军研究组里，进行了三甲川菁染料的合成，他们是通过使用3种吲哚啉季铵盐（n1/n2=1：2）和原甲酸三乙酯经加热回流发生反应而合成的，在合成后还进一步研究了其光电性质，其中染料N羧苄基染料的合成路线如图1-19所示31。图1-18 水溶性不对称菁染料的固相合成图1-19 吲哚三甲川菁染料的合成路线 作为近红外染料主体部分的吲哚菁染料，其荧光标记特性要明显好于其它探针试剂32,33,34。相对于吲哚菁染料而言，罗丹明和荧光素的标记特性明显不够突出。近年来，菁染料探针的应用与研究占据了市场的主导地位。从此不难看出，其他生物荧光探针染料的优势将逐渐被菁染料所取缔，至此，菁染料将在特异性定向荧光标记领域发挥越来越重要的作用28。1.2菁染料的光谱性能1.2.1菁染料分子吸收光谱分子吸收光谱与菁染料分子的结构有关。在菁染料分子中随着共轭体系的延长，HOMO轨道与LUMO轨道的能级差不断减小，这将导致染料吸收光的能量减小，波长增长。菁染料分子中与共轭体系相连的各种取代基对吸收光谱有不同影响。主要分为以下4类：1不饱和集团。染料中常见不饱和基团有、和等。除碳碳双键外，都是吸电子基团。染料中不饱和基团的存在延长了共轭体系，通常引起吸收光向长波长方向移动，然而只引入这类基团，红移的效果不明显。2.带孤对电子的供电子基。这类基团主要有、等。当这些基团与共轭体系相连，其中p轨道上的孤对电子形成p-共轭，偶数交替烃转变为奇数交替烃，从而吸收波长产生较大红移。3.供电子基与吸电子基的协同作用。当一个共轭体系中既存在供电子基又有吸电子基，染料分子会形成供吸电子体系，这时就会产生波长的明显红移。4.取代基空间阻碍作用。共轭体系中如果存在较大取代基，往往会引起键的旋转，这将在一定程度上破坏分子的共平面性，从而引起分子吸收光谱的改变。同时空间阻碍作用会引起基态和激发态分子能量的变化，在一般共轭发光体系中，空间阻碍会引起吸收峰的蓝移。1.2.2菁染料分子荧光光谱在物质分子中处于基态的电子当受到光照的时候会吸收能量，由原来的基态向较高能级态产生跃迁，跃迁到激发态，当电子由激发态回落到基态的过程中，便会以发光的形式释放出能量，这一过程中所产生的光即为我们所说的荧光。菁染料中由于含有共轭甲川链，从而形成了一个大的共轭体系，这种结构决定了染料的主要吸收带的范围，使得染料分子的最大吸收波长和发射波长处于近红外区域内，在进行荧光标记的时候，能够很好的避免玻璃仪器自发荧光所产生的背景影响。不同的菁染料具有不一样的光谱吸收和发射范围。通常来说，菁染料中的共轭体系越大，分子的基态与第一级激发态之间的能差也就越小，分子的最大吸收波长越长。一般甲川链上每增加一个双键可使染料分子的最大吸收波长红移100 nm，例如本论文所要研究的三甲川类吲哚菁染料的最大吸收波长在500600 nm 范围内，在相同条件下五甲川类吲哚菁染料最大吸收波长在640680 nm 范围内，而七甲川类吲哚菁染料的最大吸收波长在775800 nm 范围内。因此，可以通过变化共轭甲川链的长短来达到调节吲哚菁染料最大吸收波长的目的，使菁染料的最大吸收波长增长，从而避开玻璃和实验基质在紫外光下自发荧光的干涉。对于生物大分子例如对于蛋白质、核酸的标记来说能够非常有效地降低所产生的背景干扰，而且由于菁染料本身具有较好的荧光特性，所以也更好的提高了荧光标记检测的灵敏度。假如染料荧光分子是弱酸或弱碱，那么分析荧光光谱对于溶液的pH和氢键能力是非常敏感的。此外溶剂重原子效应、表面活性剂、散射光和拉曼光等环境因素会影响荧光光谱和荧光强度。1.2.3菁染料的聚集染料分子间以及染料分子与溶剂之间的范德华力促使染料聚合或自聚，染料在溶液中的聚集是常有现象。当染料浓度很低时染料主要以单分子状态存在，随着染料浓度的增加，染料分子会缔合为二聚体或多聚体。菁染料之间的不同相互作用，使聚集表现为不用的堆积结构，通常被描述为H-聚集体（蓝移）和J-聚集（红移）。染料单个分子的轴线与染料分子聚集体中心线之间的夹角称为滑移角。当32产生J聚集，导致分子吸收峰红移，当32产生H聚集，导致分子吸收峰蓝移。聚集形式不仅与染料分子结构有关，也依赖于多种环境因素例如染料浓度、溶剂的极性、pH值，离子强度和温度等。染料在溶液中的聚集模式如图1-20所示35。a砖砌型排列b梯型排列c楼梯型排列为滑移角图1-20 菁染料在溶液中不同聚集模型 1.3菁染料的分离、提纯 在合成菁染料的过程中，会产生许多副产物，而且他们的极性也极为相近，因此，目标产物的分离提纯就变得非常困难，当分子中引入水溶性磺酸基以后，分子极性增大，水溶性增强，更加地增大了菁染料分离提纯的难度，对于水溶性菁染料，国内外普遍使用C-18 反相柱对其染料进行分离提纯，以反相C-18（4075 m，100 A）为填料, 甲醇和水为洗脱剂梯度洗脱36,37。在我国，对菁染料提纯的方法目前也主要以C-18反相柱分离为主，而在近期才开始有用丙酮38与水的混合液进行重结晶提纯方法见报道。而正相硅胶柱层析分离法39，由于其具有试剂制备方便、硅胶再生性能良好等优点，一直被众多学者所探索。溶剂去除方面，目前普遍利用旋转蒸发仪将溶剂旋干40。所得产物通过氢核磁共振进行了结构确认，从而优化实验工艺流程。1.4选题背景和依据水溶性菁染料因磺酸基的引入而具有较好的水溶性，因此，在生物荧光标记领域能够得到广泛的应用。当进行生物分子标记成像分析时，具有较大的Stokes位移的荧光吲哚菁染料分子，因其可以减少吸收光谱与发射光谱的自吸收干扰，并且分子的吸收波长和发射波长都在近红外区域内，可有效减少标记蛋白质被生物组织自体荧光的干扰41。而单侧水溶性吲哚三甲川菁染料恰恰具有较大的Stokes位移。所以本文将试图合成两种不同取代基的单侧水溶性吲哚菁染料，并对其光学性能进行测试。作为菁染料中的一个分支，单侧水溶性吲哚三甲川菁染料的合成目前还没有实现商品化，其主要原因是合成的收率偏低，一般在30%左右。其产品的纯度也不够理想42。如果能将单侧水溶性吲哚三甲川菁染料合成过程中的每一步粗产品都能分离出来，且寻找到更为优化的分离方法和分离条件，将大大推动菁染料的研究进程。并且，还可以通过对实验机理的探索，得出每一步反应的最佳条件，进而对已知实验工艺加以改进。所以本文还将通过正相层析硅胶法对单侧水溶性吲哚菁染料的分离进行探究，找出分离效果最佳洗脱剂种类及配比。37第2章实验部分2.1实验试剂及仪器实验使用的主要仪器如表2.1所示。 表2.1 实验主要试剂一览表试剂名称纯度厂家对肼基苯磺酸化学纯天津四通化工厂3-甲基-2-丁酮分析纯天津市天力试剂厂甲苯分析纯沈阳市东化试剂厂吡啶分析纯北京益利精细化学品有限公司邻二氯苯分析纯北京化学试剂公司异丙醇分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂氢氧化钾分析纯天津市凯通化学试剂有限公司无水乙醚分析纯沈阳市东化试剂厂冰醋酸分析纯天津市天达净化材料精细工厂甲醇分析纯天津市富宇精细化工有限公司对氯甲基苯甲酸分析纯长春化学试剂厂溴化苄分析纯天津市天河试剂厂丙酮分析纯沈阳市东陵市红日化工厂乙酸乙酯分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂二氯甲烷分析纯天津市富宇精细化工有限公司硅胶分析纯青岛海洋化工厂原甲酸三乙酯化学纯天津市富宇精细化工有限公司甲醇分析纯天津市富宇精细化工有限公司C-18反相硅胶分析纯大连依利特科学仪器有限公司正丁醇分析纯天津市东丽区天大化学试剂厂实验使用的主要试剂如表2.2所示。表2.2 实验主要仪器一览表名称型号产地核磁共振仪AVance-600瑞士Bruke公司双光束紫外可见分光光度计TU-1901北京普析通用仪器有限责任公司荧光光谱仪LS 55美国Perkin Elmer公司752-紫外可见分光光度计752型山东高密分析仪器厂手提紫外分析仪JS-350B上海培清科技有限公司超声波清洗器SK2200H上海科导超声仪器有限公司旋转蒸发器RE-52AA上海亚荣生化仪器厂真空干燥箱DZF-6021上海精宏试验设备有限公司低温恒温反应浴DFY-5/30巩义市予华仪器有限责任公司数显智能控温磁力搅拌器SZCL-巩义市予华仪器有限公司增力电动搅拌器JJ-2江苏市金坛市医疗仪器厂电热鼓风干燥箱102-2A天津市泰斯特仪器有限公司电子天平BS200S北京赛多利斯天平有限公司循环水真空泵SHI-B浙江临海市精工真空设备厂集热式磁力加热搅拌器DF-巩义市予华仪器有限公司2.2中间体合成路线2.2.1水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的制备以对肼基苯磺酸为原料，与3-甲基-2-丁酮在氮气保护的条件下发生环合反应制备水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸，路线如下：2.2.2水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾盐的合成用甲醇溶解制得的2,3,3-三甲基-3H-吲哚磺酸，加入KOH及异丙醇，制备水溶性2,3,3-三甲基-3H吲哚-5-磺酸钾，路线如下：2.2.3水溶性中间体吲哚钾盐的N烷基化用对氯甲基苯甲酸、对甲基氯化苄作烷基化试剂通过取代反应生成2种水溶性吲哚季铵盐，路线如下：R = -p-CH2C6H4COOH 或 -p-CH2C6H4CH32.2.4水溶性吲哚三甲川菁染料的合成2.2.4.1水溶性N-羧苄基吲哚三甲川菁染料（Cy3a-1）的合成将N-对羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾和没有N-烷基化的2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾在碱性吡啶存在下与原甲酸三乙酯进行缩合反应制得不对称的水溶性羧苄基吲哚三甲川菁染料，路线如下：2.2.4.2水溶性N-甲基苄基吲哚三甲川菁染料（Cy3b-1）的合成将N-甲基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾和没有N-烷基化的2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾在碱性吡啶存在下与原甲酸三乙酯进行缩合反应制得不对称的水溶性甲基苄基吲哚三甲川菁染料，路线如下：2.3中间体的合成2.3.12,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的合成反应温度优化第一组采用传统的Fisher 法43进行合成，将9.300 g对肼基苯磺酸溶解在30 ml冰醋酸中，磁力搅拌下缓慢滴入3-甲基-2-丁酮15.5 mL，氮气保护条件下90 油浴加热，反应6.5 h，然后冷却至室温。向所得溶液中加入大量丙酮，抽滤析出，得到大量粉红色固体（水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸），干燥后称得10.560 g。记该组为第一组，作为对照组。再使用同组仪器设备，采用单变量法只改变温度一项变量，其余条件与首次反应条件保持相同。依次重复进行试验，回流后，油浴温度设定每次升高10，每隔1 h 取一次样，TLC（薄层色谱）检测，记录反应终点时间。2.3.22,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾的合成方案优化2.3.2.1加热搅拌法合成2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾向150 ml三口瓶中加入干燥的水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸12.600g（0.0537 mol），KOH4.430 g（0.079 mol，理论应为4.428 g），异丙醇30 mL，纯甲醇30 mL（溶解KOH），在60 水浴及磁力搅拌下反应30 min，然后冷却至室温（土黄色），向反应液中加入大量乙醚抽滤，干燥后得到土黄色固体（水溶性2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾）13.655 g，粗产率92%。 2.3.2.2常温析出法合成2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾在烧杯中用纯甲醇溶解12.610 g 2.3.2.1中使用的同批干燥的2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸，然后向此甲醇溶液中滴加氢氧化钾的异丙醇饱和溶液，随着氢氧化钾饱和溶液逐渐的加入，烧杯中有晶莹闪亮的土黄色针状固体定量析出。静置一段时间后过滤，金黄色固体产品用乙醚洗涤三次，然后放入真空干燥器中干燥一晚，最终称量得固体13.210 g ，粗产率95.4%。2.3.3水溶性中间体吲哚钾盐的N烷基化2.3.3.1N-对羧基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾的制备将3.342 g氯甲基苯甲酸 、5.450 g 2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾盐、40.0 mL邻二氯苯投入150 mL三口圆底烧瓶中，磁力搅拌，在N2环境下加热至109 ，使用温度计监控瓶内温度，恒温下反应12 h 后，停止加热，冷却至室温，有大量深紫红色固体附着在瓶底，液体澄清，用超声波振动2 min后，移去溶剂，固体用异丙醇清洗三次后研磨，研磨充分后，再次用异丙醇冲洗三次后抽滤，得深紫红色粉固体5.020 g，粗收率67.3。产品未经进一步提纯，直接用于下一步反应。2.3.3.2N-对甲基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾的制备将5.554 g (0.022 mol )2,3,3-三甲基-3H吲哚-5-磺酸钾盐溶于40.0 mL甲苯中，加入3.152g (0.022mol)对甲基氯化苄，在N2 保护下加热回流25 h。冷却至室温后，部分溶剂减压旋蒸去除，析出固体，抽滤，滤饼用甲苯淋洗，得产物3.940 g，产率47%。产品未经进一步提纯，直接用作下一步反应。2.3.4水溶性直链三甲川菁染料的合成2.3.4.1水溶性直链三甲川菁染料(Cy3a-1)的制备将7.660 g (0.020mol) N对羧苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾(3)与13 mL吡啶加入到25 mL圆底烧瓶中，在N2 保护下，加热回流10 min ，再以每次1.0 mL 每隔15 min 加一次的速度将6.8 mL ( 约0.040 mol) 的原甲酸三乙酯滴入溶液中，反应3.5 h 后冷却。将瓶中溶液倒入盛有300 mL 乙醚的1000 mL 的烧杯中，迅速析出大量红色固体，抽滤，滤饼用过量甲醇溶解，然后加入大量异丙醇将固体再次析出，静置30 min 后，抽滤，用少量异丙醇洗涤滤饼一次，再用无水乙醚洗涤两到三次，最后得到粗固体产品收率43.7%。2.3.4.2水溶性直链三甲川菁染料(Cy3b-1)的制备及合成方案优化将4.872 g (0.012 mol) N-对甲基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸钾(3)与8 mL吡啶加入到25 mL圆底烧瓶中，在N2 环境下，加热至回流，保持回流10 min 后 ，再以每次1.0 mL 每隔15 min 加一次的速度将3.7 mL (0.022mol) 的原甲酸三乙酯滴入溶液中，反应2 h 后冷却。加入大量乙醚，迅速析出大量红色固体，抽滤，滤饼用过量甲醇溶解，然后加入大量异丙醇将固体再次析出，静置30 min 后，抽滤，用少量异丙醇洗涤滤饼一次，再用无水乙醚洗涤两到三次，得粗固体产品收率41%。用醋酐代替吡啶，重复上述试验过程操作，得粗固体产品收率77.0%。2.4目标染料的分离纯化2.4.1C-18反相柱层析法水溶性吲哚三甲川菁染料在合成过程中因其步骤较多，导致中间体和副产物种类繁杂，由于这些物质极性相近，这就给产品的分离纯化增加了难度。经查阅文献，分离提纯吲哚三甲川菁染料大都选择了C-18反相柱层析分离法。将30.0 g C-18反相填料（大连依利特4075 m100 ）与一定量的甲醇洗脱剂调成悬浆状，快速倒入内径约25 mm的砂芯柱内，打开活塞，使溶剂慢慢下降而均匀沉入色谱柱底。待沉淀完全，用洗耳球敲打一下，赶走柱里的气泡，使洗脱剂与硅胶平面相齐。经甲醇浸泡12 h，而后沉柱6 h。分别采用水与甲醇的体积比为1:8、1:6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1的共计9种配比的洗脱剂对C-18反相硅胶柱开始依次梯度洗脱，选用水与甲醇体积比为1 : 8的洗脱剂对粗产品进行梯度洗脱，经3655 h后洗脱完毕，对于染料Cy3a-1，分离所得收集液颜色分别为浅棕黄色、浅黄色、红色、深红色、粉色、淡粉色 ; 对于染料Cy3b-1 分离所得收集液颜色分别为浅亮黄色、浅粉色、红色、粉色。在将分离出的目标产物进行旋转蒸发，旋转蒸发仪设置为真空度0.080.06 KPa ，温度4555，至染料旋干为止。此外，选用水与甲醇体积比分别为1:6、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1的洗脱剂对粗产品进行梯度洗脱的平行实验，寻找最佳洗脱剂配比。经产品颜色对比，发现水与甲醇的体积比为6:1的洗脱剂分离出的溶液红色带部分效果较好，纯度较高，且具有较好的金属光泽。2.4.2湿法硅胶柱层析法2.4.2.1吸附剂种类的选择选用染料Cy3b-1作为实验染料样品，水与甲醇的体积比为6:1的混合溶液作为展开剂。将40 mL适量的展开剂倒入21 cm*12 cm*30 cm层析缸中，高度约为0.5 cm，盖好盖子待下步使用。本实验选用层析用正相硅胶为吸附剂。将吸附剂层析用硅胶均匀的平铺在21 cm*6 cm规格的玻璃板上，用刮板棒从玻璃板底部向上均匀平推，制得固定相厚度为0.30.5 mm，厚度不超过2 mm，薄厚均匀且表面平整的层析板，完成干法薄层层析板的制备。制板后用微量进样器吸取5 L浓度为0.4%的吲哚三甲川菁染料溶液，在距离薄层板一端边缘12 cm处轻轻点样，圆点直径约为46 mm，进样量5 L，点样完毕之后，将薄层板置于层析缸内，浸入展开剂中，展开剂液面与薄层板之间夹角不得大于15，迅速盖好缸盖，用展开剂进行层析实验。待溶剂前沿上升到离终点约1 cm处时，取出层析板，用笔尖画下前缘的位置，量取原点中心到各个染色斑点中心的距离，及原点中心到溶剂前缘间的距离。记算出比移值Rf（Rf=原点中心至分离后形成斑点的中心距离/原点中心到溶剂前沿距离）。2.4.2.2展开剂组分配比的选择本实验首先以甲醇与水的混合液为基础，分别对乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂进行了有效探索。共分两组进行。第一组为甲醇：水比例的选择。按照实验2.4.2.1中的层析实验方法，选用体积比为6 ：1的甲醇与水的混合溶液作为展开剂，使用层析用硅胶作为吸附剂进行层析实验，测量出原点中心到各个染色斑点中心的距离，及原点中心到溶剂前缘间的距离，并分别计算出比移值Rf。另外，按照以上方法完成以体积比为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8的甲醇与水的7种组分配比混合溶液作为展开剂，以层析用硅胶作为吸附剂的层析实验，并分别计算出比移值Rf，作为平行参照。第二组为甲醇/水混合溶剂分别与乙醇、正丙醇、丙酮比例的选择。将等体积比甲醇与水的混合溶液作为A液，乙醇作为B液，选用层析用硅胶作为吸附剂。向A液中投入B液，配制成B液与A液的体积比分别为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8的7种不同组分配比的展开剂，留做进一步层析实验，记录实验现象，并计算出各自的比移值Rf。分别将正丙醇和丙酮作为B液，按照以上方法进行层析实验，记录实验现象，并计算出各自的比移值Rf。2.4.2.3正相硅胶柱的制备取70 g层析用硅胶，加入200 mL超纯水浸泡12 h后，将湿硅胶装入直径2.6 cm高40 cm的层析柱，轻轻搅拌排出气泡，将层析柱下部活塞夹打开，同时将硅胶悬浊液倾入层析柱中，反复加水使硅胶沉淀均匀且柱中无气泡，装好后将层析柱上下活塞夹关闭封好备用。将装好的层析柱分别与HL-2恒流泵和BS2-100自动部分收集器连接，调整好流速，设定好自动部分收集器的时间，准备进样。2.4.2.4正向硅胶层析柱分离将2.4.2.3中预装好的正向硅胶层析柱层析柱连接好，用甲醇：正丙醇：水体积比为1：4：1的混合溶剂作为展开剂，对流速2滴/s和进样量1.34 g的N-甲苄基水溶性吲哚三甲川菁染料分离。通过BS2-100自动部分收集器将不同颜色的分离产品收集进不同容器中。2.4.3正向硅胶柱层析法溶剂的去除将2.4.2.4中由湿法层析硅胶柱分离出的收集样液置于150 mL单口瓶中，在真空度为0.080.06 KPa，温度为8085的条件下经减压旋转蒸发仪旋蒸。当混合溶液蒸发到1 mL以下时，再取少量甲醇将其溶出，置于50 mL单口瓶中。用玻璃套管固定后，在真空度为0.07 KPa，温度为4555的条件下旋干。置于真空干燥箱中干燥，待下步使用。2.4.4正向硅胶的再生染料分离后，将使用过的硅胶置于500 mL烧杯中，利用自来水反复冲洗至原色，再用无水乙醇冲洗23次，而后经过超纯水反复清洗3次，将冲洗好的硅胶放入超纯水中浸泡，以备再次使用。2.5染料结构表征将2.4.3中所制得染料干品中称取35 mg，经二甲基亚砜（DMSO-d6）溶剂溶解，制得待检样管，1HNMR检测，解析确定染料结构。2.6紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱的测试将目标染料真空干燥，称3 mg配成浓度为1.010-4 mol/L的25 mL甲醇母液。分别取0.1 mL与小瓶中，减压蒸馏、悬干，配成5种2.010-6 mol/L的染料溶液，溶剂分别为去离子水、DMF、DMSO、乙醇、甲醇，进行紫外可见吸收和荧光发射光谱测试。2.7目标染料在不同pH水溶液中的光谱性能测试从1.010-4 mol/L的25 mL甲醇母液中吸取0.10 mL溶液于5 mL容量瓶中，不同pH水溶液定容，室温避光12 h后进行紫外可见吸收和荧光发射光谱测试。第3章 结果与讨论3.1染料中间体的合成及优化3.1.12,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的合成反应温度优化在合成2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的过程中，温度至关重要，温度过高产物会焦化，合成失败，温度过低则会延长反应时间，本实验期间通过单变量法寻找最佳反应条件，共合成2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸11次，通过数据比较，发现反应过程中的油浴温度的控制在比回流温度高出30为宜，反应回流4 h后取样，通过TLC法检测，原料点消失，可知反应终止。第一次实验中由于温度控制过低，当升高加热套温度时，温度计显示温度又过高，以至于反应温度控制不恒定，造成生成物产率较低，之后的几次实验中总结经验发现应使温度计温度快速升到所需温度，当离温度接近所需温度时在降低加热套温度使其温度恒定到所需数值。此外，在投料的过程中应该严格控制反应物的摩尔比，冰醋酸不可以加的太多，20 g对肼基苯磺酸对应60 mL冰醋酸，否则在分离产品时容易失败，与此同时，这样可以避免有更多的副产物产生。经计算收率为83.2%。3.1.22,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐的合成方案优化本实验中尝试使用两种方法：第一种是使用常规的加热搅拌法，将KOH 固体研磨成粉末后直接加入到2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸的甲醇与异丙醇溶液中，60恒温水浴加热，机械搅拌进行反应，之后用乙醚析出固体，再抽滤，并用乙醚淋洗以除去杂质。使用机械搅拌的主要原因，是避免固体KOH不能迅速的分散均匀，造成局部碱浓度过大，同时使反应物混合均匀充分反应，并使生成物迅速分散。第二种是不加热，在常温下析出的方法，先在烧杯中用纯甲醇溶解干燥的2,3,3-三甲基-3H吲哚-5-磺酸，然后向此甲醇溶液中滴加氢氧化钾的异丙醇饱和溶液，随着氢氧化钾饱和溶液逐渐的加入，烧杯中有晶莹闪亮的金黄色针状固体定量析出，然后将烧杯置于超声波清洗器中30 s，移出静置一段时间后过滤，金黄色固体产品用乙醚洗涤三次，得到高纯度的磺酸K盐。所得到的中间体要自然干燥，置于阴凉处密封保存，经实验证实合成的中间体真空烘干过程中容易变质，再用于制备季铵盐时得不到所需的吲哚季铵盐。从实验中知道磺酸钾盐的制备会受到水的影响，在之前的制备过程中没有进行试剂的预处理，所以得到的磺酸钾盐容易变为粘稠状的暗红色物质；在将试剂预处理后产物质量较好。在转移的过程中尽量避免接触金属制品，根据以往经验吲哚磺酸钾盐在接触金属制品后会缓慢变为红色，所以得到的钾盐在转移的过程中要尽量避开与金属制品接触。中间体自然干燥后密封保存，防止钾盐在空气中长时间放置会潮解变质。通过比较发现，直接加入KOH 固体粉末的方法制得的中间体，实验较好的一次产率为82.1%。与此相比，常温析出的方法得到较高纯度的晶体，产率最高可达85.2%，且