糖尿病患者血小板线粒体功能和DNA分析-科技计划项目申报（任务）书.doc

项目编号：20122A049专题名称：社会发展攻关计划(医疗)技术领域：临床医学专题编号：诊疗科目：内分泌专业是否愿意纳入指导性项目：中 山 市 科 技 计 划 项 目 申 报（任 务）书 项目名称：糖尿病患者血小板线粒体功能和DNA分析计划类别：科技攻关计划申报单位：中山市陈星海医院所在地区：小榄镇推荐单位：中山市卫生和计划生育局申报日期：2012年4月24日中 山 市 科 学 技 术 局二零零八年制承担单位基本情况表项目名称糖尿病患者血小板线粒体功能和DNA分析起止时间2012年5月1日 至 2014年3月31日单位名称中山市陈星海医院法人代码G1917103-3地址邮编528415传址E-M单位类型其他单位特性事业单位单位负责人陈伟强职务职称院长电研管理人杨新魁职务职称教授电目负责人黄汉伟职务职称副教授电目联系人黄汉伟职务职称副教授电担单位年产值：0(年销售量：0(出口创汇：0经济效益(万元/万美元)年利税：0(年研究开发经费：0职工总数：820(技术人员数：742承担单位人员情况其中：高级职称：80(中级职称：145主要参加单位单位(1)名称暨南大学医学院地址广州市黄埔大道西601号单位类型高等院校联系人江振友电单位盖章)单位(2)名称地址单位类型联系人电话(单位盖章)2知识产权状况表单位拥有知识产权状况:专利申请专利授权发明实用新型软件版权总数总数(项数)申请授权申请授权单位其中:近三年课题组其他知识产权状况说明项目技术及知识产权状况：项目阶段前期研究技术水平国际领先课题组活动类型应用研究自主研究技术来源项目已有知识专利申请专利授权发明实用新型软件版权总数总数(项数)申请授权申请授权产权状况11其他需要说明的事项：3申请项目基本情况表（一）项 目 组 主 要 成 员（含项目负责人在任务分工栏注明）：姓名年龄职务职称分工所在单位（简称）签名黄汉伟43副院长、副教授、副主任课题设计、主持科研中山市陈星海医院医师梁碧瑜26硕士研究生负责实验准备及课题实施中山市陈星海医院江振友49系主任、党支部书记；教负责课题技术指导暨南大学医学院授刘裕30医师、硕士研究生收集病例及统计分析实验中山市陈星海医院数据蔡雪36医师、硕士研究生收集病例及统计分析实验中山市陈星海医院数据项目内容摘要（主要研究内容、关键技术、特色和创新等，不超过23行）：由于糖尿病（DM)发病比较缓慢隐匿，所以临床DM早期诊断比较困难，对DM早期的研究比较受限制，导致许多DM 患者就诊时间比较晚，常常已出现并发症，预后比较差。另外，对DM病人并发症病情的研究受到取材的限制。所以，寻 求更快捷方便有效的方法解决以上问题势必会极大地促进DM临床研究的发展。以往的研究发现，血小板功能在DM早期， 未出现血管病变时，已发生改变：血小板活性较正常人增强，血小板的体积和表面积均增大，颗粒、致密体和线粒体密 度均显著增加。有研究发现2型DM患者血浆中丙二醛(malondialdehyde，MDA）的含量增加，其血小板的MDA含量也增加 。而MDA是氧化应激反应的标记产物。可见DM患者整个机体氧化应激反应增强，血小板也不例外。血小板还有自己的特 性：血小板没有核，但是有完整的细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化，也可以作为研究DM并发症的对象；血 小板取材方便，可以弥补其他组织取材困难的不足。因此，我们使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型， 探讨糖尿病对线粒体机能的影响，观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。4申请项目基本情况表（二）经济筹集情况： （单位：万元）总投入经费：20自有资金贷款境外资金政府部门其它合计市科技局镇区配套其它部门已投入经费新增经费10.0010.0020政府部门、境外资金及其他资金投入情况说明：新增经费预算： （单位：万元）总经费市科技经费支出经费经费额用途说明经费额用途说明基建费其中设备购置费21其2.00购买、租用相关实验设备1.00购买、租用相关实验设备中专用业务费21其1.00购买技术资料、参加学术交流等0.50购买技术资料、参加学术交流等中1.00实验设计、项目调研、技术培训0.50实验设计、项目调研、技术培训等等原材料费157.5其15.00购买试剂、动物、消耗性耗材等7.50购买试剂、动物、消耗性耗材等中其 他1.00项目管理费等0.50项目管理费等合 计2010填表说明：1.市科技经费：向市科技局申请的经费。 2.原材料费：包括元件、材料、试剂、配套设备部件等。 3.设备购置及使用费：包括专用设备购置及一般设备的使用等。4.专用业务费：包括该项目的设计、调研、资料、技术培训、技术会议、外事、检测、外协加工费等。5申请项目基本情况表（三）一、立项依据1.目的意义：血小板变化可以反映DM心血管并发症的病情状况。因此，血小板是一个很好的研究DM不同病程机体线粒体变化的对象。然而有关DM血小板线粒体机能变化未见系统报道，目前大多数文献还是局限于血小板止血凝血的作用方面的。但是，国外有研究提出，血小板的功能远远不只局限于此，甚至这可能只是它的一个辅助性的功能。血小板还有自己的特性：血小板没有核，但是有完整的细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化26，也可以作为研究DM并发症的对象；血小板取材方便，可以弥补其他组织取材困难的不足。因此，我们使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型，探讨糖尿病对线粒体机能的影响，观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。6申请项目基本情况表（三）一、立项依据2.国内外概况：血小板变化可以反映DM心血管并发症的病情状况。因此，血小板是一个很好的研究DM不同病程机体线粒体变化的对象。然而有关DM血小板线粒体机能变化未见系统报道，目前大多数文献还是局限于血小板止血凝血的作用方面的。但是，国外有专家提出，血小板的功能远远不只局限于此，甚至这可能只是它的一个辅助性的功能。国外有研究指出，血小板还有自己的特性：血小板没有核，但是有完整的细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化26，也可以作为研究DM并发症的对象；血小板取材方便，可以弥补其他组织取材困难的不足。因此，我们使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型，探讨糖尿病对线粒体机能的影响，观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。7申请项目基本情况表（三）一、立项依据3.应用前景和发展趋势：使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型，探讨糖尿病对线粒体机能的影响，观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。8申请项目基本情况表（四）二、研究开发内容、方法、技术路线1.具体研究开发内容和要重点解决的技术关键问题：糖尿病（diabetes mellitus，DM）由于发病率高，药物治疗效果差已经严重影响了接近9.7%的中国人的正常工作和生活 。血糖增高是糖尿病的主要症状，也引起DM患者的一些生理生化的改变，比如代谢紊乱，DNA损伤和细胞凋亡等。 DM的并发症几乎可以累及全身各系统器官。据查，国外有专提出了线粒体损伤学说，认为它是DM并发症的共同机制 ，但是该学说的4条通路之间的联系机制还是不明确。糖尿病引起线粒体损伤的一个主要原因是高糖可以导致很多组织，例 如视网膜组织细胞，肾系膜细胞产生过多的的O2。利用扫描电镜技术可以观察到，DM患者骨骼肌线粒体旁大量空泡堆 积，提示DM患者的线粒体从机能到超微结构都受到损伤。早发现，早治疗可以有效控制糖尿病的并发症。 由于糖尿病（DM)发病比较缓慢隐匿，所以临床DM早期诊断比较困难，对DM早期的研究比较受限制，导致许多 DM患者就诊时间比较晚，常常已出现并发症，预后比较差。另外，对DM病人并发症病情的研究受到取材的限制。所以， 寻求更快捷方便有效的方法解决以上问题势必会极大地促进DM临床研究的发展。 以往的研究发现，血小板功能在DM早期，未出现血管病变时，已发生改变：血小板活性较正常人增强，血小板的体积和表面积均增大，颗粒、致密体和线粒体密度均显著增加。有研究发现2型DM患者血浆中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量增加，其血小板的MDA含量也增加。而MDA是氧化应激反应的标记产物。可见DM患者整个机体氧化应激反应增强，血小板也不例外。 但是有关DM血小板线粒体的研究很少。前期实验中，我们初步观察了DM患者的血小板三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate, ATP)含量和线粒体膜电位(mitochondrial menbrane potential, MMP, m)，发现m下降而ATP含量增高21 。ATP含量增加是线粒体活动加强的结果，而m的下降是细胞凋亡早期的一个标志。血小板变化可以反映DM心血管并 发症的病情状况。因此，血小板是一个很好的研究DM不同病程机体线粒体变化的对象。然而有关DM血小板线粒体机能变 化未见系统报道，目前大多数文献还是局限于血小板止血凝血的作用方面的。但是，据查，国外有专家提出，血小板的功 能远远不只局限于此，甚至这可能只是它的一个辅助性的功能。 血小板有自己的特性：血小板没有核，但是有完整的细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化，也可以作为研究DM并发症的对象；血小板取材方便，可以弥补其他组织取材困难的不足。因此，我们使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型，探讨糖尿病对线粒体机能的影响，观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。2.项目的特色和创新之处：血小板有自己的特性：血小板没有核，但是有完整的细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化，也可以作为研究DM并发症的对象；血小板取材方便，可以弥补其他组织取材困难的不足。因此本项目取材方便、便捷、经济。 由于糖尿病（DM)发病比较缓慢隐匿，所以临床DM早期诊断比较困难，对DM早期的研究比较受限制，导致许多DM 患者就诊晚，预后差。另外，对DM病人并发症病情的研究受到取材的限制。所以，寻求更快捷方便有效的方法解决以上 问题势必会极大地促进DM临床研究的发展。以往的研究发现，血小板功能在DM早期，未出现血管病变时，已发生改变： 血小板活性较正常人增强，血小板的体积和表面积均增大，颗粒、致密体和线粒体密度均显著增加。有研究发现2型DM 患者血浆中丙二醛(malondialdehyde，MDA）的含量增加，其血小板的MDA含量也增加。而MDA是氧化应激反应的标记产 物。可见DM患者整个机体氧化应激反应增强，血小板也不例外。血小板还有自己的特性：血小板没有核，但是有完整的 细胞器，所以可以用来观察DM中线粒体的变化，也可以作为研究DM并发症的对象；血小板取材方便，可以弥补其他组织 取材困难的不足。因此，我们使用血小板作为研究对象来建立新的、快捷的实验模型，探讨糖尿病对线粒体机能的影响， 观察糖尿病并发症的发病情况，为DM患者体线粒体机能的相关研究提供理论基础。9申请项目基本情况表（四）二、研究开发内容、方法、技术路线3.要达到的技术、经济指标及社会、经济效益：培养硕士研究生1名，发表论文1-2篇。目前中国糖尿病患者有9000万，中国成为仅次于印度的全球糖尿病患者人数第 二大国。糖尿病发病率一直逐年增加，并已成为危害人民健康的严重疾病。因此针对糖尿病的研究有重要的社会及经济效 益。4.采用的方法、技术路线以及工艺流程：1临床病例采集广东医学院附属中山市陈星海医院内分泌科收治的2型DM患者10人（DM组），健康成年人10人（对照组）肘前静脉 血。DM组均为初次诊断为2型糖尿病收治入院的患者。两组一般资料见表1。比较2组血小板在4、37下静置2、24 h后 血小板线粒体机能的变化。2 取材DM患者及健康成人，用EDTA抗凝管抽取肘前静脉血3mL，150 g 离心10 min，得到的淡黄色上清即为富含血小板的血浆。 3 观察指标3.1 血小板计数 4保存的富血小板血浆稀释20倍以后，取10L计数。 3.2 流式细胞仪检测血小板线粒体膜电位 上流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测线粒体膜电位。流式细胞仪的设置为FL1 (Florescence Channel 1)的PMT（PhotoMultiplier tube)值为551BP(Band Pass Filter)，FL2的PMT值为536BP。数据用WINMDI软件分析流式密度图的红色荧光和绿色荧光的百分率3.3 MTT检测血小板活力MTT 10L，酶标仪(Bio-Tek) 570nm波长测量各孔的吸光值。 3.4透射电镜观察血小板超微结构透射电镜(Tecnai Spirit)观察血小板形态。10申请项目基本情况表（五）三、工作基础和条件1.承担单位概况（人员、资产、业务与管理状况）：中山市陈星海医院是1984年由香港榄镇同乡会永远首席会长陈星海先生捐资扩建的全民所有制公立二级甲等医院。2002年成为“广东省高等医学院校教学医院”，2008年成为“广东医学院硕士研究生培养基地”，2010年成为“广东医学院非直属附属医院”、中山市首个“广东省专科医师培训基地”，是暨南大学医学院教学基地。医院现有在职员工850余人，其中专业技术人员755人，高级职称101人（主任医师20人），研究生导师6人，国家级学会任职2人，省级学会副主委2人，常委8人。医院目前开放病床700张，设有内科一区（呼吸、心血管）、内科二区（消化、内分泌、肾内）、内科五区（肿瘤、血液）、脑系科（神经内科、神经外科）、外科二区（微创肝胆、普外、泌尿、肛肠）、外科三区（骨科）、妇科、产科、妇产科门诊、儿科、重症医学科（ICU）、耳鼻喉科、眼科、口腔科、门急诊科、皮肤科、中医科、康复科、检验科、核医学科、放射科、超声科、心（肌）电图室、体检中心、消毒供应中心共25个临床（医技）科室，医院年门诊量121万余人次，年住院病人2.3万余人次，年手术量6000余例。微创肝胆外科、呼吸内科为中山市“十二五”医学重点专科；神经内科、神经外科、中西医结合肛肠诊疗中心为中山市“十二五”医学特色专科；微创肝胆外科陈伟强、呼吸内科冯起校为中山市“十二五”医学学科带头人。近年来，获省、市级科研立项共计96项，其中：省科委科研立项3项，省卫生厅医学科学基金课题6项，市科技局立项48项，市级科技局科研成果奖8项。近五年来，全院开展新诊治技术项目207项，在国内期刊上发表医学论文633篇，其中有2篇论文在国际著名期刊 Cellular Oncology和Cancer letter发表。由我院组织编写的4本专著临床教学大巡诊病例释析与进展、现代社区临床诊疗 纲要、专科医师培训指南内科病例讨论和专科医师培训指南呼吸与危重症医学科必读，先后由广州出版社和人民卫 生出版社出版。2002年至今，先后承办了20余次大型学术论坛，包括“基层医院呼吸病学论坛”、“基层医院消化病学论坛”、“微创 泌尿外科学术论坛”、“精确肝胆肿瘤治疗学术论坛”、“基层医院临床护理教学师资培训班”等国家级、省级继续教育项目。2人参 加国际学术会议并在大会交流论文。2.本项目现有的研究工作基础（包括现有科研装备条件）：1、中山市陈星海医院是暨南大学医学院教学基地，其中内分泌科拥有糖尿病诊治相关的先进技术设备和雄厚的专家团队，每年收治的糖尿病患者病例数充足，满足开展课题的基本条件。项目负责人黄汉伟是陈星海医院副院长、内分泌内科副主任医师，广东医学院兼职副教授，广东省医师协会内分泌科医师分会委员、广东省药学会内分泌代谢用药专家委员会委员、中山市医学会内分泌暨糖尿病代谢学委员会副主任委员。1991年暨南大学医学院临床医学专业本科毕业。在诊治糖尿病、甲状腺疾病、痛风、继发性高血压等各种内分泌疾病方面具有丰富的临床经验，曾获中山市科技成果奖1项。在国家级、省级杂志公开发表医学专业学术论文10余篇。2、承担本项目实验的广州暨南大学放免实验室，具有多年从事血小板方面的研究工作经验；发表相关的论文多篇；近4年来，一直关注于血小板作为中枢神经系统外周模型的研究；经过我们大量相关的预实验工作和资料查讯，结果提示血小板线粒体衰老模型为研究中枢神经系统衰老提供了良好的条件。所以，本研究项目立题依据充分，方法可靠，工作基础扎实。本项目的提供主要技术指导者江振友，系医学硕士，教授，硕士生导师。暨南大学医学院微生物学与免疫学系主任。中国共产党暨南大学医学院基础党总支微生物学与免疫学党支部书记。中国微生物学会医学微生物学与免疫学专业委员会委员，中华医学会微生物学与免疫学分会青年委员会委员，广东省中西医结合实验医学专业委员会委员，广东省预防医学会微生物学与免疫学专业委员会委员。主持承担国家、省部级等各类科研课题5项,主要参加的研究课题8项。3.对环境的影响及预防治理方案：本项目在医院及实验室内完成，对环境不会造成不良影响11申请项目基本情况表（六）四、本项目各个参加单位工作分工及经费投入、支出情况12申请项目基本情况表（七）五、以往承担项目完成情况及主要成果（近五年内）1.承担国家、省部、市级有关课题完成情况：（立项年度、项目名称、计划类型、完成时间、政府资助经费、完成效果等）1、2004年获中山市科技局立项，编号2004C028，项目负责人：黄汉伟，项目名称：细胞因子在肾综合征出血热病毒感染人外周血单核细胞中的作用；2、2008年获中山市科技局立项，编号20082A096，项目负责人：黄汉伟，项目名称：代谢综合征及2型糖尿病社区综合防治体系的建立与评估。3、2009年获中山市科技局立项，编号20091A105，第二完成人：黄汉伟，项目名称：脂联素对正常糖耐量、GIGT及GDM孕妇子代作用的临床研究。 4、桑树的化学表征信息数据库构建及其抑菌和抗病毒作用机制，（NO: 9351064001000002） 广东省自然科学基金研究团队项目，2009年7月-2012年6月，主要成员（分课题排名第2）江振友。5、登革病毒对人血管内皮细胞表达ICAM-1的影响及其分子机理的研究，（NO:2008342）。广东省医学科研课题。 2008年7月-2010年6月，主持人：江振友。已结题。2.以往科技成果应用情况：（技术成果名称、实施单位、实施地点、实施时间、实施效益等）黄汉伟为第二完成人：1999年，经内镜置放国产镍钛记忆支架治疗气道狭窄的临床研究，内科，获中山市科技局科技技术进步奖二等奖，该科技成果在多家基层医院推广应用。3.已发表的与本项目研究有关的主要论文、专著与获奖情况：（年度刊物等说明）黄汉伟第一作者发表的论文：1、2004年，解剖学研究，型糖尿病患者血浆可溶性凝血酶调节蛋白的变化及临床意义；2、2004年，中国临床医学月刊，浅谈糖尿病酮症酸中毒的诊治探讨（附24例）；3、2004年，中华临床医学研究杂志，12例Graves患者服用抗甲状腺药物致甲减的临床分析；4、2004年，中华临床医学研究杂志，糖尿病慢性并发症的临床分析（附72例）；5、2005年，河北医学，糖尿病合并肺结核42例的临床探讨；6、2005年，河北医学，糖尿病酮症酸中毒的诊治探讨；7、2009年，中国现代医生，老年糖尿病并低血糖昏迷20例的探讨。江振友第一作者发表论文：1、 江振友，邹林，施珊珊，卢燕茹，董军，杨春华，卢业成，戴国奎。姜黄素对SiO2诱导小鼠矽肺模型TNF-、TGF-1表达的影响。2009年，25（5）。细胞与分子免疫学杂志。2009年，25（5），399-401. 2、江振友，史毓杰，刘小澄，黄汉伟。肾综合征出血热病毒对人外周血单个核细胞产生细胞因子的影响。免疫学杂志 ,2005,21(5)：598-600。13申请项目基本情况表（八）六、工作进度安排工作进度主要工作内容2012年5月1日 至 2012年11月30日收集和研究项目相关技术，设计实验路线，准备相关实验设备，开展早期实验研究2012年12月1日 至 2013年7月31日根据早期实验