海洋贝类腺体内五种游离生物激素的负化学源GCMS连续分析.ppt

海洋贝类腺体内五种游离生物激素的 负化学源GCMS连续分析研究 徐继林 严小军 叶芳挺 刘才才 宁波大学 浙江省海洋生物工程重点实验室 贵阳 2004.9.23 目的意义 n生物激素对生物体的生长发育和繁殖有着重要的 生物学意义。 对海洋贝类而言，主要有两类物质，一类是直接 作用于相关受体的小分子物质包括肾上腺素（L- Epinephrine,EPI）、去甲肾上腺素（L-Norepine phrine,NEPI）和多巴胺（Dopamine,DOP）等；另 一类是甾醇类激素如17-雌二醇（17- Estradiol,EST）和孕酮(Progesterone,PG)等，它们 通过调控第一类物质的合成代谢和分泌对生物体 起生殖调控作用。 n为了解它们在生物体内的合成代谢途径以及从环 境中富集的程度大小，需要对它们在生物体内含 量进行准确灵敏的测定。 由于它们在生物体内含量很小，而研究过程中生 物样品数量也很少，所以如果能够将它们通过一 定的方法一次性测定出来将有很重要的现实意义 。 n已经有大量生物体体液或组织 中的激素测定报道，但大多是针 对某种激素或是一类激素的研究 ，还未见将上述两类激素一次性 连续测定的报道。 负离子化学（Negative Chemical Ion , NCI）源 的气相色谱质谱联用（GC/MS）分析对具有强电 子亲和力的化合物有着较高的灵敏度。 本研究建立了NCI源气相色谱质谱联用检测海 洋贝类腺体内5种激素的连续分析方法，以期为 研究激素在贝类生物体内的调控作用提供方便灵 敏的检测手段 材料与方法 实验材料 n 实验试剂 激素标准品（纯度98%，美国SIGMA-ALDRICH公 司）；七氟丁酸酐（Heptafluorobutyric Anhydride, HFBA,）(美国Alltech公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美 国TEDIA公司）；其他试剂均为国产分析纯。 实验材料 n 实验仪器 QP2010 型 GC-MS 联用分析仪，带 AOC-20 自动 进样器（日本 SHIMADZU 公司）；30m0.25mm 0.25 m SPB-1色谱柱（美国 SUPELCO 公司）；固 相萃取装置（美国 SUPELCO 公司），C18固相萃取小 柱（美国 SUPELCO 公司），冷冻干燥机（韩国 ILSHIN公司），超纯水仪（法国MILLIPORE公司）。 另外，国产高速分散匀质机、旋转蒸发仪、旋涡混合 仪、高速离心机、电子天平等。 实验材料 n实验样品 2004年3月购自宁波市场的鲜活野生一龄曼氏无针 乌贼（Sepiella maindroni）和一龄野生褶牡蛎（Ostrea plicatula），解剖后取性腺，用高速分散匀质机匀浆后 冷冻干燥备用。回收率实验采用缢蛏(Sinonvacula constricta)肌肉样品，高速分散匀质机匀浆冷冻干燥后 备用。 标准溶液配制 20.0 mg 激素标准品 酸性甲醇(0.1mol/L HCl) 4.0mL 5 mg/mL的 标准贮备液 制作工作曲线时再取此储备液用甲醇 配制成其他浓度的标准溶液。 样品预处理 0.1g 左右样品 0.5 mL 7 mol/L的甲酸 涡旋震荡2 min、超声抽提5 min 4000 rmin 离心5 min 上层液 0.5 mL 7 mol/L的甲酸 重复抽提2次 合并上层液 1.5 mL 7 mol/L 氨水 4000 rmin 离心5 min 上层液 0.1mL/min C18 固相萃取柱 3 mL 去离子水淋洗 3 mL 80% 丙酮水溶液洗脱 旋转蒸发 40水浴 干 50 L HFBA衍生剂 130油浴20 min 氮气吹 近干 乙酸乙酯/醋酸酐定容 1:1(V/V) 1.0 mL GC/MS分析 GC/MS定量定性分析 1.分析条件 GC条件：进样口温度250，载气为99.999%的 高纯氦，总流速20 mL/min , 柱流速1.50 mL/min , 柱前压112.4 kPa, 柱起始温度100，保持3.5 min，以20 /min升至120 后以2 /min升至 150 ，再以25 /min升至280 保持10 min。 不分流进样1 L。 GC/MS定量定性分析 1.分析条件 MS条件：采用NCI源分析，反应气为甲烷，离子源温度200 ，接口温度250，选取全程离子碎片扫描（SCAN）模式 时，质量扫描范围为1501000。选取特征离子碎片扫描（ SIM）模式时，NEPI选择m/z 541、953和 213作为特征碎片 离子；DOP选择m/z 543、721和 476作为特征碎片离子；EPI 选择m/z 770、558和 213作为特征碎片离子； EST选择m/z 644、428和 197作为特征碎片离子；PG选择m/z 490、470和 178作为特征碎片离子；每组特征碎片离子中，前一个离子作 为定量时的目标离子，后两个离子作为定性时的参考离子。 GC/MS定量定性分析 2.定性分析 保留时间: 相同的色谱条件下与标准色谱图进行对照 ，根据保留时间确定样品中激素类化合物 五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图 GC/MS定量定性分析 2.定性分析 质谱图: 5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图 GC/MS定量定性分析 3.定量分析 根据样品中所含各激素的特征离子 信号响应强度，用外标法求出各激素的 含量。 。 GC/MS定量定性分析 4.回收率、精密度测定 向0.1g 未检出激素的缢蛏肌肉干样中分 别加入激素各50 ng，按照上述分析条 件测定该样品中各激素的含量，平行测 定三次 。得方法的回收率和精密度。 结 果 工作曲线 5 种激素的线性方程 激素 Hormone 线性方程 Calibration equation 回归系数 Regression coefficie nt 浓度范围（ng/mL） Range of concentration NEPI Y = 653 X 0.9942 2.5200.0 DOP Y = 564 X 0.9993 2.5200.0 EPI Y = 1035 X 0.9955 2.5200.0 EST Y = 1606 X 0.9998 2.5200.0 PG Y = 85 X 0.9999 2.5200.0 回收率和精密度 检测 限 根据性噪比为3，用QP2010气相色谱-质谱分析仪随 机所载SNRATIO软件，可计算出各标准物浓度为2.5 ng/mL的信噪比，从而根据式MDL=3CN/S计算出仪 器的检测限 方法的检测限： 5种激素的仪器检测限均小于1ng/mL 样品中激素的含量 n取0.1 g 左右曼氏无针乌贼和野生褶牡蛎的性腺按上 述条件平行测定3次(表4)，各激素含量在未检出到 17.92 ng/g 范围内。 讨 论 衍生条件的选择 由于各种激素分子上都带有两个以上的可衍生基团，所以在不同 的温度条件下会有不同的衍生方式，而衍生时间又会影响衍生程度。 在过低的温度下过短的时间衍生往往不很充分 选择130油浴20 min 过长时间过高温度条件又会带来较多的副产物而影响方法的灵敏度 五种激素标准品衍生物在不同测定模式下的色谱图 可见各衍生物都有良好的响应信号 5种激素的HFBI衍生物NCI源的质量谱图 Epinephrine, C9H13NO3, 183.20 Norepinephrine, C8H11NO3 , 169.18 Dopamine, C8H11NO2 , 153.18 Estradiol , C18H24O2 , 272.38. Progesterone , C21H30O2, 314.46 197 HFBA 除NEPI出现了衍生物的分子离子信号（m/z 953）外，其他 激素衍生物的NCI-MS中均未出现分子离子信号，但都出现 了M-HF-信号（DOP中的721、EPI中的947、EST中的644和 PG中的490）,由此也可确定出在所确定的衍生条件下NEPI 衍生上了4个7F基团，DOP衍生上了3个7F基团，EPI衍生上 了4个7F基团，EST衍生上了2个7F基团，PG衍生上了1个7F 基团。 提取、纯化条件的选择 提取 ： DOP、EST、PG最常的的提取溶剂为甲醇， 但该研究对象为含脂肪含量很高的生物样品 ，而且NEPI和 EPI均难溶解于大多有机溶剂 甲 醇 酸性水 NEPI和 EPI可以溶解于酸性水（pH5），少 量的DOP、EST和PG也可溶于酸性水（pH=1左 右）中 兼顾两者，用有机酸 7mol/L甲酸溶液（pH=1左右） 提取、纯化条件的选择 纯化 ： NEPI、EPI和DOP这类儿茶酚胺类激素，可 用WCX弱离子交换柱富集，再用甲酸洗脱得 到良好的回收率（Zamecnik等，1997）。但 实验表明固醇类激素在弱极性柱上保留效果 不佳 固醇类激素，用C18柱富集，甲醇洗脱后再 过硅胶柱，正己烷脱脂肪后用1:1 二氯甲烷/ 乙酸乙酯洗脱 （Casademont等 ，1996）。 但实验表明这一类激素在硅胶柱上损失很大 甲酸溶液提取，氨水中和离心可去除部分 蛋白，样品过C18柱后用80%的丙酮水洗 脱，可以尽量减少脂类物质的干扰，直接 回收率在14.84-74.31%之间，与资料结果 （Casademont等，1996）类似。 不足 本方法采用外标法进行定量分析 对于有