《细菌的遗传分析》PPT课件.ppt

第六章 细菌的遗传分析 重点：转 化、接 合、性 导、转 导 第一节 细菌的一般特点 第六章：细菌的遗传分析第六章：细菌的遗传分析 一、细菌的细胞与染色体 1、大小: 细胞较小、长约12、 宽约0.5； 2、结构：细胞壁、质膜、细胞质及 内含物、拟核、核糖体、鞭毛 ； 3.遗传物质：单个主染色体、一个 或多个小染色体(质粒)； 4.繁殖：每个细胞在较短时间内(如 一夜)能裂殖到107个子细胞成为 肉眼可见的菌落或克隆(clone) 后代。 细菌细胞结构模式图 细菌细胞结构解析图 5、细菌的染色体 E. ColiE. Coli DNADNA 细菌基因细菌基因 组组DNADNA由由5050 100100个环个环 或结构域或结构域 组成，各组成，各 个结构域个结构域 可保持不可保持不 同水平的同水平的 超螺旋超螺旋. . 分支点分支点 超螺旋超螺旋 6、细菌的繁殖方法 大肠杆菌的培养通 常用LB培养基： 每升培养基含水解 酪蛋白10克、 NaCl 10克、5克酵母提取 物，pH 7.0。制平板 用的固体培养基还要 加15克琼脂粉，然后 高压灭菌。 液体培养: 37， 280-300rpm。 二：E. coli 的突变型及筛选 1、细菌的突变型 （1）、原养型：野生菌株则可在基本培养基上生长 。 用不同的选择性培养基 测知突变的特性。 （2）、营养缺陷型： 丧失合成某种营养物质的 能力，不能在基本培养基 上生长的突变型； （3）、抗性突变型： 如抗药性或抗感染性。 例如：青霉素（penr） 抗性突变的菌落 （4）、其它突变型： 耐高温、降解环境污染物、某种物质的产量特高等。 2、测定突变的方法影印法 黎德伯格等(Lederberg J.和Lederberg E. M.,1952)设计 丝绒印在丝绒印在 母板上母板上 吸附细菌吸附细菌 再印在选择再印在选择 培养基上培养基上 链霉素链霉素 筛选出抗链筛选出抗链 霉素的菌系霉素的菌系 挑出单菌落放入挑出单菌落放入 选择性培养基鉴定选择性培养基鉴定 Lederberg J.,1958 Nobel奖获得者，发现 细菌转导和接合 3、细菌的遗传重组方式 一个菌株的DNA与另一菌株DNA的交换重组 可以通过四种方式实现： . 接 合 . 性 导 . 转 化 . 转 导 接合和性导是通过一种叫F质粒或F因子的介质将 供体细菌的DNA转移到受体细胞中的。 转导是通过噬菌体将供体细菌的DNA转移到受体 细胞中的。 三、细菌的质粒 1、定义：质粒是细菌染色体以外的遗传物质，双链环 状DNA，不是细菌正常生长和繁殖所必需，但可以使 含有质粒的细菌具有一些独特的生物学特性。 2、特征： . .有自我复制的能力：一个质有自我复制的能力：一个质 粒就是一个复制子粒就是一个复制子 紧密型：与染色体同步复制紧密型：与染色体同步复制 松弛型：独立复制松弛型：独立复制 .赋予细菌某些表型 F 质粒：致育性质 粒； R 质粒：耐药性质 粒； Vi质粒：毒力质粒 ; Col质粒：细菌素 质粒； 代谢质粒。 .可分为相容性与不相容性两种 相容性：几种质粒共存于一个细菌内； 不相容性：几种质粒不能存于一个细菌内。 .可自行丢失或人工消除 消除后相应的特性也消失 .可在细菌间转移 接合、性导等方式 3、重要的质粒 . 质粒(致育质粒)：是决定大肠杆菌不同菌株细胞 间遗传物质转移能力的一种致育因子(fertility factor),又叫因子、性因子(sex factor)。约为 细菌组DNA的2，94.5kb，其基因组中包括转移、 复制和插入等基因簇。 . 耐药性质粒：编码重金属盐类和抗生素的耐受性, 包括接合性(R)耐药性质粒和非接合性耐药性质粒。 . 毒力质粒或Vi质粒：编码与致病性有关的致病因子 ,如大肠埃希菌质粒编码的耐热性肠毒素(ST)和不耐 热性肠毒素(LT)。 . 细菌素质粒：编码各种细菌素,如大肠杆菌Col质粒 编码的大肠杆菌素。 . 代谢质粒：编码产生各种相关的代谢酶,如沙门菌 发酵乳糖的能力是质粒编码。 他们选择了两个不同营养缺陷型的 E.coli菌株 A菌株：met- bio- thr+ leu+, 需加甲硫氨酸和生物素； B菌株：met+ bio+ thr- leu-， 需加苏氨酸和亮氨酸。 A + B 菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后 离心，洗涤，然后涂布到基本培养基上培养，长出了原 养型（Met+ bio+ thr+ leu+）菌落。 第二节：大肠杆菌的性因子和接合 1946年，Lederberg和Tatum发现E.coli细胞之间通 过接合可以交换遗传物质 一、大肠杆菌的遗传重组现象 大肠杆菌的遗传重组现象图示 A A 菌株菌株 metmet- - bio bio- - thr thr+ + leu leu + + B B 菌株菌株 metmet+ + bio bio+ + thr thr- - leu leu - - 完全完全 培养基培养基 完全完全 培养基培养基 210210 8 8 细胞细胞210210 8 8 细胞细胞 110110 8 8 细胞细胞 110110 8 8 细胞细胞 完全完全 培养基培养基 离心洗涤离心洗涤离心洗涤离心洗涤离心洗涤离心洗涤 metmet + + bio bio + + thrthr+ + leu leu + + 基本培养基基本培养基 无菌落无菌落无菌落无菌落 基本培养基基本培养基基本培养基基本培养基 频率为10-7 二、前述遗传重组的特点 1 1、形管实验证明，遗传物质的传递需要细胞的直接、形管实验证明，遗传物质的传递需要细胞的直接 接触接触 A、B两个菌株分别培 养在装基本培养基的U形 管内，U形管底部是细胞 不能透过，而DNA等大分 子能自由进出的隔膜。 不断地加压和吸引使培养 液反复混合下培养，结果是两 边的培养基上均未长出原养型 细菌。 直接接触(接合)是原养 型细胞出现的必要条件。 2、接合过程是一种单向转移 遗传物质的过程 海斯(Hayes W.,1952)的实验： F首先用高剂量的链霉素处理菌株1或菌株2（用链霉 素处理菌株可以阻碍细菌的分裂，但不杀死它们）， F处理过的菌株1+未处理过的菌株2 基本培养基 上有存活的菌落 F处理过的菌株2+未处理过的菌株1 基本培养基上 没有存活的菌落 F不是一个交互的过程 F证明：接合过程是一种单向转移接合过程是一种单向转移遗传物质的过程。 三、F 因子 F因子上具有4060 个蛋白质基因,每个 细胞内24个F因子。 F因子可整合到细菌的基 因组DNA上，这样的细菌 叫高频重组(Hfr)品系。 HayesHayes等（等（1953)1953)发现发现供体有一个性因子(即F因子): FF因子是染色体外一种附加体,即环状DNA(F质粒)。 F携带F因子的菌株称为供体菌或雄性,用F表示；未 携带F因子的菌株为受体菌或雌性， 用F表示。 FF因子可从F向F 的转移。 FStrR就在F质粒上 。 F F因子结构因子结构 致 育 基 因 配对区 原原 点点 OriTOriT F - - F+ F F Hfr F - - F+ 从F+到Hfr的整合过程 细菌 基因组 F+细胞 F质粒 F+质粒的配 对区与细菌 基因组内一 些特定区段 相互靠近。 整合整合 F+因子 Hfr基因组 整合的整合的 F F+ + 因子因子 整整 合合 后后 四、细菌的结合示意图 5 F菌毛 整合管 五、细菌重组的特点 1.单数交换：打开环状染 色体，产生一个线性染 色体，这种细胞因没有 线性染色体的复制机制 而不能成活。 2.偶数交换： 产生可遗传 的重组子和 一个片段。 1.一次双交换 只产生 一种重 组子。 六：中断杂交与基因重组 为了证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直 线式进行的，Jacob和Wollman在五十年代设计了一个著 名的中断杂交试验。即用Hfr菌株与F-菌株混合培养。 Hfr菌株：strS a+ b+ c+ d+ 对链霉素敏感 F- 菌株： strR a- b- c- d- 抗链霉素 实验程序如下实验程序如下： 1、基本做法 得到结果是： 在每个时间点取的样中，分别具有 a+、b+、c+或d+ 的菌落有多少。 不不 同同 时时 间间 取取 样样 搅搅 拌拌 器器 中中 断断 杂杂 交交 稀稀 释释 菌菌 液液 含含 完完 链链 全全 霉霉 培培 素素 养养 的的 基基 HfrHfr 菌菌 株株 不不 能能 繁繁 殖殖 长长 出出 抗抗 strstr 菌菌 落落 挑挑 逐逐 单单 个个 菌菌 培培 落落 养养 鉴鉴 出 定定 出出 a a+ + 现现 b b+ + 情情 c c+ + 况况 d d+ + 况 2、实验原理 Hfr菌株：苏氨酸(thr+)、 亮氨酸(leu+)、抗叠氮化物 (azir)、抗T1噬菌体(tonr) 、半乳糖(gal+)、乳糖 (lac+) F 菌株：thr 、leu 、 azis、tons、gal 、lac 型。 . 8. 8分钟时分钟时 thrthr + + 进入进入F F ； ； 8.58.5分钟时分钟时 leuleu + + 进入进入F F ; ; . 9. 9分钟时出现分钟时出现aziazi r r 的菌落的菌落 ； . 11. 11分钟时出现抗噬菌体分钟时出现抗噬菌体 T1T1的的F F 细菌（ 细菌（tonton r r ）；）； . 18. 18和和2525分钟时：分别出分钟时：分别出 现乳糖和半乳糖发酵基因现乳糖和半乳糖发酵基因 ，即，即laclac + + 和和galgal + + 进入进入F F 细 细 胞。胞。 3、中断杂交实验结果 重组子中各标志基 因进入F-细胞中时间 不同，达到最高水平 的时间也不同； 随时间的推迟，有 某个基因的菌落增加 ；一定程度后，便不 再增加。 如：10 tonr首次出现 , 15时40%、25 后80% Hfr中的基因是按一 定的线性顺序依次进 入F-菌株的。 4、根据中断杂交实验结果绘制遗传图 以各个基因出现的时间(分钟)为单位，就可作出大 肠杆菌的遗传连锁图。 在大肠杆菌中，通过实验知道平均每分钟转移33kb 以后，还可将连锁图转换为基因组物理图。 5、环状连锁图 、用不同Hfr菌株进行中断杂交实验，作出环状连锁 图，其基因向F-细胞转移的顺序有可能不同： 为什么转移顺序是乱的？为什么转移顺序是乱的？ 原因是，不同原因是，不同HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入的因子插入的 位置和方向不同位置和方向不同! ! 、不同Hfr菌株的F因子插入位点 Hfr H：lacthr thi malA serA tyrA his recA att Hfr H： Hfr H： Hfr H：thrlac att recE his tyrA serA malA thi 6、重组作图 两基因转移时间间 距2分钟时，中 断杂交法的图距不 够精确，应采用传 统的重组作图法。 例如，有乳糖不发 酵突变体lac-和腺 嘌呤缺陷型ade- 两 个菌株，这两个紧 密连锁基因间的重 组作图方法如右图 所示。 HfrHfr laclac + + adeade + + (str(str S S ) F) F laclac adeade ( (strstr R R ) ) 完全培养基培养完全培养基培养 选择性培养基培养选择性培养基培养 （不加腺嘌呤，加链霉素）不加腺嘌呤，加链霉素） 获得获得F F adeade + + 菌落菌落 F F adeade+ + lac lac 基因间发生交换基因间发生交换 F F adeade+ + lac lac + + 基因间未发生交换基因间未发生交换 乳糖作碳源乳糖作碳源 结合的两基因间重组频率 lac-ade+ 重组率= 100% = 22% (lac+ade+) + (lac-ade+ ) 中断杂交连锁图的每分钟约相当于20%的重组值。 lac+ lac ade+ ade lac+ lac ade+ ade ade ade+ lac lac+ 片断丢失片断丢失片断丢失片断丢失 ade ade+ lac+ lac 亲本型重组型 如如这端后这端后 进入受体进入受体 一、F因子 1、概念概念 第三节：F因子与性导 细菌基因组细菌基因组 内不止一个内不止一个 整合位点整合位点 tsxtsx tonton laclac + + tsxtsx tonton laclac + + 错位环出错位环出 ( (偶尔发生偶尔发生) ) 细菌细胞细菌细胞 仍然具有全仍然具有全 部基因部基因 F因子 lac+ HfrHfr中的中的 F F 因子因子 偶尔在环出时不够准确偶尔在环出时不够准确 , , Adelberg和Burns (1959)发现FF因子因子。 会会携带出携带出E.coliE.coli 染色染色 体上的一些基因体上的一些基因, , 这种这种 因子称为因子称为FF因子因子。 HfrHfr laclac + + tsxtsx tonton laclac+ + 供体供体( (含含F F ) ) laclac+ + 2、F因子的特点 . F因子转移基因的频率极高，如同 F+ 因子； . F因子自然整合率极高,并且整合在一定的座 位上, 携带了细菌染色体的同源区段。而正 常F因子可在不同座位整合。 . F 因子可以携带的染色体节段大小：从一个标 准基因到半个细菌染色体。 结合过程结合过程(F(F因子的转移因子的转移) ) 供体供体( (含含F F ) )受体受体(F(F ) ) laclac 二、性导 1 1、性导的概念性导的概念 通过F 因子进行的遗传物质传递与基因重组叫性导。 2 2、性导在遗传研究中的作用、性导在遗传研究中的作用 .可分离出携带有大肠杆菌基因组不同部位的大量F 因子，部分合子重组子连锁遗传图连锁遗传图； .性导部分二倍体等位基因的显隐性关系显隐性关系等； .性导形成的部分二倍体可用作互补测验互补测验确定两个突 变类型是否属于同一个基因。 laclac + + 供体供体( (含含F F ) ) laclac + + laclac 供体供体( (含含F F ) )受体受体(F(F ) ) 结合过程结合过程(F(F因子的转移因子的转移) ) laclac + + laclac laclac + + 仍然是仍然是HfrHfr laclac + + 部分合子部分合子 供体供体( (含含F F ) )原来的受体原来的受体 第四节、转化 1 1、转化的概念、转化的概念: 某些细菌通过细胞膜摄取周围来自供 体的外源DNA片段,并将其通过重组过程整合到自己 基因组内的过程。外源DNA片段的导入方法很多。 一、转化（transformation） 2 2、转化实验由来已久、转化实验由来已久：1928年格里费斯（Griffith F. ）在肺炎双球菌中发现转化现象。1944年阿委瑞（ Avery O.T.）进行肺炎双球菌转化试验；证实DNA是 遗传物质供体DNA与受体细胞间的接触与互作。 3 3、转化实验仍在发挥重要作用、转化实验仍在发挥重要作用 基因操作技术离不开的转化实验(酵母菌） . PCR产物的克隆鉴定、原核表达转化大肠杆菌 . 基因功能研究酵母菌双杂交转化酵母菌 . 研发转基因动物、转基因植物等 需要转化 . 基因功能研究基因扣除法 需要转化 4、转化过程中外源DNA的摄取 .穿入的DNA分子结合在接受座位接受座位上(可逆)，或被DNA 酶降解；接受座位饱和性DNA摄取(不可逆)，不受 DNA酶破坏。穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解双 链中的一条链。 .剩下的单链剩下的单链按各个位点与互补的受体DNA片段联会。 亲缘关系越远，联会越小、转化的可能性越小。 .整合过程就是DNA重组过程，具有同源DNA特异性。 5、影响大肠杆菌转化的因素 、影响转化的因素包括、影响转化的因素包括： .片段大小:肺炎双球菌的成功转化，需要外源DNA片 段至少800bp,枯草杆菌最少需要16kb .片段形态:用于转化的外源DNA片段必须是双链 .片段浓度:每个细胞摄取的DNA分子数10个 .受体细胞生理状态；感受态。 、受体的生理状态、受体的生理状态 活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA, 所以感受态是细菌处于生长周期的某一特定时间段 、最能摄取外源DNA而被转化的细胞状态。 具体讲，感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成 正在继续活跃地进行时的状态。 常用的大肠杆菌感受态细胞有热击转化用感受态和电 击转化用感受态两种类型。 二、用枯草杆菌进行转化和重组试验 1、紧密连锁的基因可以通过转化进行作图 trp2+ his2+ tyr1+ trp2 his2 tyr1 11801072600418685366011940数目 - - + + - - - - + + + + + + tyr1 + + - - - - + + - - + + + + his2 + + + + + + - - - - - - + + trp2 转 化 子 类 型基因座 trp2+ his2+ tyr1+(供体) trp2 his2 tyr1(受体) 的转化子统计 共转化率共转化率: : hishis 2 2 tyrtyr 1 1 trptrp 2 2 his his 2 2 trptrp 2 2 tyr tyr 1 1 , , 即即hishis 2 2 在中间。在中间。 trp2-his2重组率 = 100% 重组型数 亲型数 + 重组型数 trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + trp2 +his2 + tyr1 + 2、转化枯草杆菌三个基因的连锁图 11801072600418685366011940数 目 - - + + - - - - + + + + + + tyr1 + + - - - - + + - - + + + + his2 + + + + + + - - - - - - + + trp2 转 化 子 类 型基 因 座 trp2+ his2+ tyr1+(供体) trp2 his2 tyr1(受体) 的转化子统计 17990 20172 19905 = 13.3 = 40.3 = 34.1trp2 his2 107+6853660 2390 2390 418+1180 15600 11940 his2 tyr1 3660+685107 8125 8125 2600+1180 12047 11940 trp2 tyr1 3660+4181180 6785 6785 2600+107 13120 11940 重组率()重组类型亲本类型基因间 连锁图：trp2 his2 tyr1 0 13.3 47.4 34.1 第五节、转导（transduction） 1. 1. 概念概念：指以噬菌体为媒介进行的细菌遗传物质重 组，是细菌遗传物质传递和交换方式之一。 2. 2. 特点特点： 以噬菌体为媒介细菌的一段染色体被错误地包 装在噬菌体的蛋白质外壳内通过感染转移到另一 个受体细胞内。所以，感染细菌的能力决定于噬菌 体的蛋白质外壳。 例如：黎德伯格与津德（1951）发现鼠伤寒沙门 氏菌中转导现象。 将