丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长.doc

丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响*马军董艳秋邹珉程联胜刘兢*（中国科学技术大学生命科学学院合肥230027）摘要抗p185 erbB2基因工程抗体是一种有潜力的抗肿瘤药物。以稳定表达抗p185嵌合抗体的重组工程CHO细胞株为对象，分别用不同浓度丁酸钠（02mmol/L）和丙酸钠 (010mmol/L) 对处在对数生长期的细胞进行处理，在连续5d的培养过程中，每隔24h取样测活细胞数量，并用ELISA检测上清中抗体含量，5d后结束培养用FACS检测细胞周期。同时还用丁酸钠和丙酸钠处理长至90满度的细胞，然后每隔12h取样一次检测葡萄糖和乳酸的含量。结果表明丁酸钠和丙酸钠可以有效地提高嵌合抗体在工程CHO细胞中的表达，表达量最高时可达58.359.6mg/L，是对照组的1.5倍。同时抑制细胞生长和阻断细胞周期在G1期，并且可减少培养过程中葡萄糖的消耗和乳酸的生成。和丁酸钠相比，丙酸钠具有较小的细胞毒性，是一种有潜力的替代品。关键词丁酸钠丙酸钠CHO细胞嵌合抗体收稿日期：20050429修回日期：20050712* 国家“863”计划资助项目(2004AA215260)* 通讯作者，电子信箱：jliu CHO细胞的蛋白表达加工能力较强，因而常用来表达外源重组蛋白。有研究表明，一种小分子短链脂肪酸丁酸钠可以提高多种外源蛋白在CHO细胞中的表达量，比如凝血因子1、组织纤溶酶原激活物(t-PA)2、促红细胞生成素(EPO)3、人血小板生成素(hTPO)4及一氧化氮合成酶(NOS)5等。表达量提高的程度因表达产物的不同而有差异。同时研究还显示丁酸钠可以抑制细胞生长,阻断细胞周期，诱导细胞凋亡等。另有报道，同属于短链脂肪酸的丙酸钠也可以提高CHO细胞中外源蛋白的表达量,比如因子6和胰蛋白酶抑制因子(AAT)7。p185是由癌基因HER-2/ebB2编码的分子量为185kDa跨膜蛋白，属表皮生长因子受体家族。一些肿瘤患者，尤其是乳腺癌患者，被发现存在有p185的过度表达8。1998年美国Genetech公司研发出第一个人源化的抗p185工程抗体药物Herceptin，并经FDA批准投入临床应用，用于治疗p185高表达的乳腺癌。抗体药物开始成为生物制药中一个引人注目的发展方向，但由于抗体药物临床治疗剂量较大，如何高效表达抗体就成了一个重要的研发环节。本实验室在自主研制的抗p185单克隆抗体的基础上，构建了一个分泌型muScFvhuFc人鼠嵌合抗体，体内外活性检测显示其具有良好的肿瘤细胞生长抑制活性。通过在CHOGS表达系统下逐步加压反复筛选，得到一株稳定表达嵌合抗体的工程细胞株,表达量为57mg/d/106细胞9,10。本实验中我们用不同浓度的丁酸钠和丙酸钠对此工程细胞株进行处理，在有血清的培养条件下观察和比较它们对细胞生长代谢和嵌合抗体表达量的影响，为优化大规模制备抗体工艺进行了探索。1材料与方法1.1细胞株与细胞培养稳定分泌表达抗p185的人鼠嵌合抗体的工程CHO细胞株由本实验室构建9,10。工程CHO细胞株常规培养在100ml Flask（Nunc公司产品）瓶中，置于37，5CO2及一定湿度的培养箱中，培养基成分如下：不含谷氨酰胺的DMEM培养基（GIBCO公司产品）添加5透析过的（v/v）的胎牛血清（杭州四季清公司产品）和1（v/v）的非必需氨基酸（GIBCO公司产品）以及各600mg/L的谷氨酸和天冬氨酸,各35mg/L的核苷酸（腺苷酸，鸟苷酸，胞苷酸，尿苷酸，胸苷酸）。2005, 25(10)马军 等：丁酸钠和丙酸钠对工程CHO细胞生长代谢和嵌合抗体表达的影响中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.10 20051.2丁酸钠或丙酸钠处理一定量的丁酸钠和丙酸钠（Sigma公司产品）溶于PBS中配成浓度分别为1mol/L的贮液，0.22m膜（millipore公司产品）滤过后保存于4冰箱。细胞按以下方法处理：(1)5105个细胞接种于100ml flask瓶中，第二天贴壁后换成新配制的含不同浓度丁酸钠（0,0.2,0.5,1,2 mmol/L）或丙酸钠（0,1,3,6,10 mmol/L）的培养基，按不同浓度各分5组，每组15瓶，以后每隔24h每种浓度各取3瓶进行细胞计数和表达量测定并取平均值，5d后结束时检测细胞周期。(2)5105个细胞接种于100ml Flask 瓶中，长至90满度后，实验组换成新配制的含1mmol/L的丁酸钠或6mmol/L的丙酸钠的培养基,对照组也同时换液但不予添加丁酸钠或丙酸钠，每种浓度设3个平行对照，以后每隔12h各取微量上清进行葡萄糖和乳酸分析并取平均值。1.3细胞计数0.25胰酶(GIBCO公司产品)消化细胞后，台盼蓝染色，在显微镜下用细胞计数板对活细胞进行计数。 1.4FACS分析细胞周期细胞消化后按每1106个/管悬浮于200l PBS中，加入2ml 70 预冷的乙醇固定30min，再将细胞离心重悬于500l含40g/ml的碘化吡啶(PI)和100g/ml的RNA酶（均为Sigma公司产品）的PBS中，37温育30min后FACS仪（BD公司产品）检测各组样品DNA的含量变化，并由此分析丁酸钠和丙酸钠处理对细胞周期变化的影响。为了减少误差，所有样品都收集固定后一同测定。1.5抗体表达量的ELISA检测上清中的嵌合抗体含量用夹心ELISA法测定，以羊抗人Fc多抗（Fizegiald公司产品）铺板（F96,Nunc公司产品），以 HRP标记的羊抗人Fc多抗（Pirece公司产品）为标记多抗，OPD进行显色反应后在490nm波长下用酶标仪（BIO-TEC公司产品）检测吸光值。抗体浓度用IgG1标准梯度对照（Sigma公司产品）来确定。1.6葡萄糖/乳酸代谢分析上清中的葡萄糖/乳酸含量分别用GOD-PAP法葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛公司产品)和乳酸脱氢酶法乳酸检测试剂盒（南京建成公司产品）测定。2结果与分析2.1丁酸钠、丙酸钠对细胞生长的影响用不同浓度的丁酸钠或丙酸钠处理细胞后，每24h取样进行计数，绘制出细胞生长曲线。由图1A可以看出：丁酸钠对CHO细胞的生长有明显的抑制作用，这种抑制作用与其浓度成正比。丙酸钠也有相似的作用（图1B），但与丁酸钠不同的是，丙酸钠对细胞生长影响较小。2.2丁酸钠、丙酸钠对细胞周期的影响用流式细胞仪对连续培养5d后的细胞进行DNA含量分析，由图2可以看出：随着丁酸钠浓度的升高，处在G1期的细胞的比例不断增加，由对照组的44增加到73。丙酸钠虽然对细胞周期也有阻断作用，但效果较弱。和图1相对照,随着细胞生长抑制的增强，G1期细胞比例也相应增加。因此细胞被阻断在G1/S交界处，可能是细胞生长抑制的主要原因之一。2.3丁酸钠、丙酸钠对抗体表达量的影响实验结果由图3可以看出：工程CHO细胞的嵌合抗体累积表达量随着丁酸钠浓度的提高而不同程度的增加，当达到1mmol/L时效果最佳，是对照组的1.5倍，但是浓度继续增加表达量反而会下降(图3A)。这可能是更高浓度的丁酸钠有过强的细胞生长抑制作用而导致细胞总数过少所致。丙酸钠的促表达作用虽然较丁酸钠弱，但是提高丙酸钠的浓度可以达到和丁酸钠相同的效果(图3B)。值得注意的是：虽然6mmol/L丙酸钠对提高抗体表达量的效果与1mmol/L丁酸钠相当，但两者对细胞生长的抑制作用并不一致，后者对细胞生长的抑制作用明显比前者强。2.4丁酸钠、丙酸钠对葡萄糖/乳酸代谢的影响分别选用促蛋白表达效果相近的1mmol/L的丁酸钠和6mmol/L的丙酸钠对长至90密度的工程细胞进行处理，此时细胞基本长满后进入稳定期，数量变化不大，可以减少细胞数差异带来的误差。每隔12h取样检测，结果见图4：丁酸钠，丙酸钠可以减少葡萄糖的消耗，抑制乳酸的生成，其中以丁酸钠的效果为强。我们还观察到在整个培养过程中，与添加了一定量的丁酸钠或丙酸钠的细胞组相比，对照组的pH变化较为剧烈，细胞易于脱落，状态较差。图1不同浓度的丁酸钠(A)和丙酸钠(B)培养液对重组CHO细胞生长的影响Fig. 1Growth profiles of recombinant CHO cells cultured in different concentration of sodium butyrate (A)and sodium propionate (B)图2不同浓度的丁酸钠(B,C,D)和丙酸钠(E,F,G)处理对重组CHO细胞周期的DNA含量的影响对照为不加处理(A)Fig. 2DNA contents histograms from recombinant CHO cells grown in different concentration ofsodium butyrate (B,C,D) and propionate (E,F,G)图3不同浓度的丁酸钠(A)和丙酸钠(B)处理重组CHO细胞对嵌合抗体表达产量的影响Fig. 3Chimeric antibody production of recombinant CHO cells treated with different concentrationof sodium butyrate (A) and propionate (B) quantitated by ELISA图4丁酸钠和丙酸钠处理对葡萄糖钠消耗和乳糖积累细胞代谢的影响Fig. 4Glucose consumption and lactate accumulationafter by recombinant CHO cellstreatments withsodium butyrate and propionate.3讨论丁酸钠可以促进多种外源蛋白在CHO细胞中的表达。对于不同的表达产物和细胞株，丁酸钠的效果和最佳浓度也有差异15。有研究表明，这与丁酸钠可以抑制组蛋白的磷酸化并诱导其超乙酰化，促进组蛋白和DNA解离，降低RNA合成酶的空间位阻，加速mRNA的合成等有关11。Steve等12认为，处在G1期的杂交瘤细胞可以更有效地分泌Mab, 因此丁酸钠的促表达效果与其阻断细胞周期在G1期有关。通过用另外一种短链脂肪酸丙酸钠对工程CHO细胞进行平行处理和比较，我们发现其与丁酸钠有着相似的效果，所以可能也是通过类似的机理发挥作用的。在实际的生产中应该综合考虑其对细胞的影响，权衡利弊。细胞培养的早期，细胞生长如果受到抑制则会延长细胞生长时间，影响细胞总量；但是在生产期，适当的抑制细胞生长却可以避免细胞过满。葡萄糖消耗和乳酸生成的减少则可以减少因葡萄糖消耗过快、pH变化剧烈给细胞带来的不利影响，从而减慢细胞衰退，延长生产时间2。此时用适当浓度的丁酸钠来提高嵌合抗体的表达量无疑是利大于弊的。一定浓度的丁酸钠还可能诱导细胞凋亡4。我们在整个细胞培养的过程中并没有观察到明显的细胞凋亡，这可能是因为在有血清培养的条件下，02mmol/L的丁酸钠还不足以引起工程CHO细胞的凋亡。Kim等13用抗凋亡基因Bcl2转染表达人源化抗体的工程CHO细胞株，从而有效地抑制在无血清培养条件下丁酸钠诱发的凋亡，进一步提高了抗体的表达量。丙酸钠和丁酸钠一样可以提高嵌合抗体在CHO细胞中的表达，虽然效果较弱，但提高浓度后可以达到同样的效果。更重要的是，在相同促表达效果的浓度下，丙酸钠显示出更小的细胞毒性，同时价格低廉，是一种有潜力的替代品。参考文献1 Dorner A J, Wasley L C, Kaufman J. Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucose-regulated proteins in butyrate-treated Chinese hamster ovary cells. J Bio Chem, 1989, 264(34): 20602206072 Palermo D P, DeGraaf M E, Marotti K R, et al. Production of analytical quantities of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using sodium butyrate to elevate gene expression.J Biotechnol，1991,19(1): 35473 刘小萍, 汪彦, 朱奎，等. 丁酸钠对CHO-EPO工程细胞株rhEPO表达量的影响. 生物工程学报, 1997,13(3):269272Liu X, Wang Y, Zhu K, et al. The effect of sodium butyrate on the expression of recombinant human erythropoietin in engineered CHO EPO cell line. Chinese J Biotechnol, 1997, 13(3): 2692724 Sung Y H, Song Y J, Lim S W, et al. Effect of sodium butyrate on the production, heterogeneity and biological activity of human thrombopoietin by recombinant Chinese hamster ovary cells. 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Biotechnol Bioeng, 2001, 71:184193Effect of Sodium Butyrate and Propionate on Cell Growth, Metabolism andExpression of the Chimeric AntibodyMA JunDONG YanqiuZOU MinCHENG LianshengLIU Jing(School of Life Science, University of Science and Technology of China, Hefei, 230027, China)AbstractOverexpression of p185, which was encoded by the HER2/erb2 protooncogene, has been reported in different types of tumors, especially in breast cancer. Athen recombinantengineering mouse/human chimeric antibody against p185 erbB2, which showed the potential to inhibit proliferation of tumor cells overexpressing p185.A mouse/human chimeric antibody was constructed and expressed in the CHOGS expression system. In the engineered CHO cells, the different concentrations of NaB (0.2,0.5,12mmol/L) or NaP (1,3,610mmol/L) was added respectively to the cultures of exponent growing cells in the presence of 5% serum. During 5 days cultivation, supernatants of the samples were taken every 24 hours for antibody detection by ELISA and the viable cell numbers were accounted using a hemocytometer. After 5 days, the cell cycles were analysed by the flow cytometry. In addition, NaB or NaP was added to the culture after the cells growing to close confluency and glucose consumption and lactate accumulation were measured every 12 hours. The results showed that both NaB and NaP addition can efficiently increase the antibody production and the highest chimeric concentration of yield was 58.359.6mg/L obtained by addition of either 10mmol/L NaB or 60mmol/L NaP, it is about 1.5 fol