工业微生物项目报告六分离纯化.doc

课程工业微生物项目名称纯化班级生化0922姓名刁永军学号0913230239项目报告成绩一 项目目的：熟练底物和TCA的配制方法，掌握最佳的底物溶解条件。熟悉酶活的测定方法。熟悉结晶的操作过程和方法。二 项目基本方案：按照不同配方配制出发酵液（在下面中会有附表），并配制好种子液。进行灭菌。灭菌完成后接种子夜，即把菌接入到发酵液中，放入摇床培养，56h时后接发酵液，即把种子液接入到发酵液中。放入摇床培养。培养48h，72h后进行测酶活。在不同时期加入不同量的硫酸铵，还要进行加Tris等操作进行结晶。三 项目所需要的设备：灭菌锅、摇床、离心机、水浴锅、分光光度计、超净工作台、分析天平、pH剂、四 项目所需要试剂和仪器：仪器：烧杯、量筒、移液器、锥形瓶、离心管若干、酒精灯、移液枪及枪头、石英夹缝比色皿试剂：棉酚蛋白 10g/L、甘油10l/L、 磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、干酪素、Tris-Hcl、三氯乙酸、乙酸钠、乙酸、硫酸铵5、 项目执行的具体步骤：确定配方：发酵液第一组：棉酚蛋白5g/L，甘油5g/L，麦芽糖5g/L，pH 6，接种量750ul。2瓶 30ml种子液：棉酚蛋白10g/L，磷酸二氢钾1g/L，Mgso4 0.5g/L, 麦芽糖10g/L配种子液和发酵液：发酵液就按以上配方配，种子液配方，将棉酚蛋白、麦芽糖、磷酸二氢钾、硫酸镁按比例溶解，装入锥形瓶中，放入灭菌锅中灭菌。接种子夜：用接种环把W1菌从固体培养基接到种子液中，用8层纱布包扎，放入摇床中培养。6h过后接发酵液，即将种子液接入发酵液中，放入摇床中，48h后进行测酶活。配制底物和TCA：称取2g干酪素溶于体积100ml、pH为8的Tris-Hcl缓冲液中搅拌至干酪素完全溶解。缓冲液：Tris-HCl 5mmol/L (PH根据实验要求配制 ) A计算出Tris-Hcl的质量： n=cv=5mmol/L*0.25L=1.25mmol Tris的质量：m=nM=1.25mmol*121.14g/mol=0.151425gB 滴加HCl至pH=8.0后定容至250ml （3）TCA：0.1mol/L三氯乙酸、0.22mol/L乙酸钠、0.33mol/L乙酸 A 三氯乙酸易潮解，在称量时，应放在玻璃器皿中，称量乙酸钠，醋酸B 将它们溶解并定容。测酶活：在超净工作台中将发酵液用移液枪取到离心管中。可以每瓶测一个，将发酵液取入离心管中，进行离心(8000r/min,5-10min左右),取出并加水稀释，放入水浴锅中（37），每组三个离心管，每个离心管中200l酶液实验组一实验组二对照组200l底物200l底物400lTCA静置10min加400lTCA静置10min加400lTCA静置10min加200l底物再静置十分钟后，把离心管放入离心机离心(8000r/min,5-10min左右)，时间到后，取出，测酶活。先在比色皿中加入蒸馏水调零，然后进行测量，每次测量前先用少量溶液进行润洗，记下每次测量的数据。7. 数据72h酶活测完后，将发酵液进行离心，取上清液，加入30%硫酸铵，按100ml16.4g的比例加，要在冰水浴中进行，搅拌完毕后放入冰箱。第二天将第一天的溶液离心取上清液，加入70%硫酸铵，按100ml43.6的比例加。8. 第三天把第二天的溶液离心取沉淀加入pH为9的Tris-Hcl缓冲液溶解，调pH至4.5，放冰箱上层静置24h，离心，取沉淀物。将沉淀物分别进行测酶活和跑电泳，将剩余沉淀物溶解于2%-5%的硫酸铵溶液中使之过饱和，将溶液放入小烧杯中，在小烧杯外面套一个大烧杯，大烧杯中放入过饱和的硫酸铵溶液，密封，放入冰箱上层。6 项目结果:到第三天离心时发现有很少沉淀，使项目无法进行下去。因此我们组重做此项目。七、结果分析（有无方案调整的需要）：在48h和72h时测酶活时发现酶