慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立及其核转位分析

慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立及其核转位分析【摘要】 目的 构建稳定表达GSTM5的人支气管上皮16hbe细胞株，探讨谷胱甘肽S转移酶mu5（GSTM5）核转位的关键因素。方法 构建表达GSTM5 基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒，感染人支气管上皮16hbe细胞后，经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆；实时荧光定量 PCR 和蛋白印迹法（Western-Blot）分别检测细胞株中GSTM5的 m RNA、蛋白表达水平；以TNF-（10 ng/mL）刺激稳转株1小时，共聚焦荧光显微镜检测GSTM5核转位。结果：成功构建了重组慢病毒表达质粒PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C并包装慢病毒，感染16hbe细胞后经嘌呤霉素筛选得到16hbe-GSTM5-SBP-3flag-N、16hbe -SBP-3flag-GSTM5-C细胞株；稳转株GSTM5基因的 m RNA 和蛋白表达显著上调；GSTM5在TNF-刺激后存在核转位，16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N稳转株核内GSTM5的量较另一个稳转株更大。结论：构建的细胞株能稳定表达GSTM5 基因，TNF-诱导GSTM5核转位与其N端含有非经典核定位信号密切相关。【关键词】 谷胱甘肽S转移酶mu 5；重组慢病毒表达质粒；16hbe；核转位前言急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一个具有复杂病理和发病机制的危重症临床综合征，其本质是肺部过度失控的炎症反应1。过度炎症反应引发氧化应激状态，诱导细胞内源性活性氧（ROS）的生成量剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力，使机体处于进行性加重的氧化应激状态，导致肺结构细胞损伤2。谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase，GST）与谷胱甘肽结合，是具有多种功能的催化氧化还原反应的酶超家族，与其他抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作用3。谷胱甘肽S转移酶mu 5（GSTM5）是GST家族的成员。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研究发现，TNF-刺激16hbe细胞后NOX1转录及表达明显上调8，GSTM5与NOX1启动子间存在着相互作用4，这引起了我们对GSTM5的关注。本研究拟构建人 GSTM5基因的慢病毒表达载体及稳定表达GSTM5的人支气管细胞系，并观察TNF刺激模拟的细胞炎症状态下GSTM5核转位情况，为后续研究GSTM5的转录调控功能奠定基础。材料与方法一、材料16HBE、293T细胞、Stbl3菌种由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰酶、谷氨酰胺（Gln）购于gibico公司；重组人TNF-购自美国Pepro Tech公司； BCA法蛋白浓度测定试剂盒、逆转录试剂、PCR、Real-time PCR 相关试剂购自TaKaRa公司；引物由上海英潍捷基公司合成。慢病毒系统（含表达载体plvx-puro-kozak-3*Flag-SBPTag2、plvx-puro-MCS-SBPtag2-3*flag和2种包装质粒psPAX2、Pmd2.G)、慢病毒包装专用促转染试剂FItran购于辉骏生物；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自Thermo Scientific公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit连接酶购自诺唯赞公司；质粒提取和凝胶回收试剂盒为 Qiagen 公司产品。Trizol 试剂、转染试剂 Lipofectamine 2000 和嘌呤霉素购自 Invitrogen 公司； ECL荧光底物试剂盒购自美国 Pierce 公司。抗flag荧光抗体（ab106221）、抗GSTM5抗体（ab112918）购自abcam。二、方法1. 重组慢病毒表达质粒PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N 、pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C及慢病毒制备：根据GSTM5（NM_000851）基因序列设计引物（序列见表1），使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段。使用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收pcr产物。2个载体与Gstm5-F2、R2的pcr产物进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的基因片段条带和酶切后的载体载体条带，回收纯化，用 T4 DNA 连接酶连接载体 和 目的基因片段，以得到重组慢病毒载体PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit无缝连接GSTM5-F/R的pcr产物及PLVX-puro-3*flag-SBP-C，以得到pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C。将10 L连接产物加入至100 L Stbl3感受态细胞中完成连接产物的转化。将菌液均匀涂布于含Amp抗生素（100 g/mL）的LB平板上，24小时后，挑取数个菌落，PCR检测目的基因表达。取10ul pcr产物点样到1% 凝胶电泳，对照Marker大小，选取正确的菌落摇菌，测序。并以双酶切鉴定所构建的2个载体。表1 引物序列Table 1 Primer sequencePrimer nameSequence（5-3）酶切/无缝连接连接载体GSTM5-FGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCatgcccatgactctggggtac 载体序列 BamHI酶切位点BamHI与XbaI酶切载体后无缝连接PLVX-puro- kozak-3*flag-SBP-CGSTM5-RTacccggtagaattaTCTAGActatttgctgttccatgtagctg载体序列 XbaI酶切位点GSTM5-F2TTC GAATTC GCCACC atgcccatgactctggggtac 酶切位点 kozakEcoRI酶切plvx-puro-MCS-SBP-3*flag-NGSTM5-R2CGA GCGGCCGC Ctttgctgttccatgtagctg 酶切位点NotI酶切测序引物CMV-FCGCAAATGGGCGGTAGGCGTG测序引物PGK3ACTTGTGTAGCGCCAAGTG2. 慢病毒包装：293T细胞在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，置于培养箱37， 5%CO2 培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90%以上聚集度时传代接种于10cm 细胞培养皿，5X106 cell/皿（总共10ml完全培养基）。24h后待细胞密度达70%-80%时即可用于分盘到150mm细胞培养盘。包装当天，即分皿24h后，给293T细胞换上20ml无抗培养基DMEM+10%FBS+4mM Gln，37、5% CO2培养箱培养2个小时。27ug的慢病毒质粒和2个辅助质粒加入1ml的生理盐水中轻柔颠倒混合，静止5min后并加入质粒2.5-3倍转染试剂Polyethylenimine，室温静置孵化20min后缓慢均匀滴入150mm培养皿中，适当摇匀；此时记为转染开始时间。转染4-6h后换液，吸取适量PBS轻轻漂洗细胞1-2次，换上培养基DMEM + 10% FBS+4mM Gln，1%P/S。3. 病毒收集：转染后48小时和72小时分别收集上清，1000rpm离心5min，取上清用0.45um微孔滤器过滤。4，25000g超高速冷冻离心机高速离心2h，弃上清，病毒沉淀用1mlPBS充分溶解，分装为100ul/管。滴度测定后-80 C 冰箱保存。切勿反复冻融，每次冻融大约有10%的损失。48h收集的上清可先置于4冰箱保存。4. 16HBE/GSTM5稳定细胞株感染、筛选：16HBE细胞传代，取5106cells/孔的密度接种至6孔板，接种4个孔待16hbe细胞贴壁汇合度为40%-50%后进行感染；感染前，每孔细胞换成无双抗1000uL新鲜的DMEM完全培养基含（10ug/ml polybrene），提高逆转录病毒感染细胞的效率，放置于培养箱孵育1h。取2孔细胞分别加入上述制备的2种GSTM5慢病毒上清液1000ul，第3孔细胞加1000ul的空载慢病毒上清液，第4孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入37、5CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。感染6小时后换成新鲜的DMEM完全培养基+1%P/S，待细胞生长至80%融合度时，加入1L的Puromycin(终浓度4ug/mL)进行药筛。每天更换含Puromycin(2ug/mL)完全培养基，直至空白细胞全部凋亡。每次更换细胞培养基均需要加入原药物浓的一半来维持细胞生长，即Puromycin的终浓度为2ug/ml。扩增培养后液氮冻存。至此，筛选得到16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C，16hbe-SBP-3*flag-NC。5. RT-qPCR检测GSTM5基因表达水平：取上述3株细胞及正常16hbe细胞铺板后按life technology公司提供的Triozol使用说明抽提RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度后去基因组DNA，逆转录合成cDNA。采用实时荧光定量 PCR 两步法定量分析各组细胞 GSTM5基因 m R-NA 表达水平（引物见表2）。反应条件：反应条件：预变性 95 3min；变性 95 10 s、退火 60 34 s、延伸72 30 s，共进行 45 个循环。循环结束后从60升高到98获取熔解曲线。结果采用公式：-CT=-【Mean（检测基因CT值）-Mean（内参基因CT值）】，-CT=-（GSTM5组CT NC组CT），相对表达量RQ=2-CT。PCR 引物序列见表 2。表2 qPCR引物基因名称Genbank ID引物序列（5-3）扩增长度GAPDH(内参)NM_002046Forward：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC226 bpReverse：GAAGATGGTGATGGGATTTCGSTM5NM_000851Forward：CCATCCTGCGCTACATTGC111 bpReverse：CCAGCTCCATGTGGTTATCCAT6.WB验证：3株稳转株及正常16hbe分别提蛋白后用BCA法测定蛋白浓度，根据定量结果，每个样本取20ug上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后分次孵育抗flag抗体（ab106221）、GSTM5抗体（ab112918）。7.细胞爬片制作，共聚焦显微镜检测：3株稳转株及正常16hbe分别传代后制作细胞爬片，传代后24小时更换含TNF-（10 ng/mL）不含血清DMEM培养基，1小时后固定细胞，孵育抗flag荧光抗体（ab106221），莱卡共聚焦显微镜绿色荧光分布，即观察GSTM5核转位。三、应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以s表示。数据均进行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用LSD检验法，方差不齐时多重比较采用Dunnetts T3检验法，P0.05为差异有统计学意义。结 果1. 成功构建表达GSTM5慢病毒表达载体，以核酸内切酶双酶切载体PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C，凝胶电泳后均呈现2条条带，见图一。2.RT-qPCR检测：16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C，16hbe- SBP-3*flag-NC 细胞株中GSTM5基因表达水平。结果显示，与16hbe- SBP-3*flag-NC、16hbe相比较，16hbe- GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C细胞中，GSTM5-mRNA表达水平显著上升（P0.05），见图二。 图2 RT-qPCR检测GSTM5-mRNA表达变化3.16hbe-GSTM5稳转株中GSTM5蛋白表达水平分析：Western Blot检测结果显示，16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C细胞中，GSTM5蛋白表达水平显著高于16hbe、16hbe-NC。而后两者之间GSTM5表达无明显差异，见图3。16hbe-GSTM5稳转株GSTM5蛋白表达水平分析Flag抗体孵育GSTM5抗体孵育GAPDH抗体孵育1234图3 1:16hbe；2：16hbe-NC；3：16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C；4：16hbe- GSTM5-SBP-3*flag-N4. 共聚焦显微镜检测： GSTM5的人支气管上皮细胞株16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N，16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C，16hbe-SBP-3*flag-NC的建立。3株稳转株经嘌呤霉素筛选8天后，制作细胞爬片后孵育抗flag荧光抗体，以共聚焦显微镜观察，所有细胞呈现绿色荧光，表明慢病毒空载体及慢病毒介导的GSTM5基因都已整合于全部16hbe细胞中。经TNF-刺激后，相比16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C ，16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N细胞株核内绿色荧光表达较强，GSTM5核转位较多，见图4。图4 GSTM5表达共聚焦荧光显微镜检测讨 论急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）的病理生理过程是炎症反应与氧化应激过度激活的过程，而且炎症反应与氧化应激密切相关5。炎症失衡诱发了氧化相关基因的过度表达及活性氧过量生成，继发氧化应激损伤，加重了肺结构细胞凋亡6, 7。在探讨TNF-诱导肺泡II型上皮细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（NADPH oxidase 1,Nox1）基因转录调控过程中，发现 TNF-刺激后，肺泡II型上皮细胞内Nox家族及ROS表达明显上调8，同时谷胱甘肽硫-转移酶mu5（Glutathione S-transferase mu 5,GSTM5）表达上调，并从胞浆转移入胞核，与Nox1启动子结合4。GSTM5属于GST家族，具有催化氧化还原反应的活性3，我们前期的部分研究也证实GSTM5能影响P38、NF-B等激酶活化，参与细胞炎症反应、凋亡等生理过程的调节9。我们推测，在ALI的发生、发展过程中，GSTM5对炎症反应及其继发的氧化应激过程有具有调控作用，其机制与Nox1基因表达密切相关。为了使 GSTM5基因能够在16hbe细胞核中稳定表达，本实验构建慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株。相比其它方法，慢病毒感染因具有随机整合到细胞基因组的特性，细胞株的建立更容易，荧光素酶基因的表达更稳定10，还能确保携带的外源基因不发生改变。慢病毒另一优点是可以同时感染有分裂能力细胞和无分裂能力细胞，是基因治疗载体的理想方案11，保证了其在在多种细胞中的应用。本研究所构建的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株，经酶切、RT-qPCR、WB验证，从基因、蛋白方面均证明稳转株构建成功，可用于下一步研究GSTM5结构、功能、相互作用蛋白等实验。另外，所构建的载体中有SBP、3*flag标签，可用后续的串联亲和纯化（TAP-MS），以便分析GSTM5的相互作用蛋白，为探究其功能提供基础。因为GSTM5不具有经典的核定位系列，我们的首要任务是要证实其在TNF-刺激诱导下能通过直接或间接的方式入核。本实验构建慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株，经TNF-刺激诱导后，荧光共聚焦显微镜显示当GSTM5位于标签的N端时（16hbe- GSTM5-SBP-3*flag-N），其核内荧光强度较另一个稳转株（16hbe-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示GSTM5的核转位与N端结构域密切相关。当GSTM5位于标签的C端时入核减少，可能与GSTM5的N端序列被标签封闭相关。Miho Kawakatsu 等人发现GSTpi的线粒体定位序列与其N端相关，其195-208aa则对其核定位有重要作用，并证实其为一种非经典核定位信号（NLS）12。经搜索expasy等数据库表明，GSTM5分N端和C端结构域，分别是1-88aa和90-207aa。鉴此，我们认为，GSTM5的N端结构域含有非经典核定位信号，对其核转位有重要作用在后续的研究中，本课题组将分别构建GV230-GSTM51-88aa-GFP及GV230-GSTM5 90-207aa-GFP载体，进一步研究这两个结构域对GSTM5的核转位影响。综上所述，本文成功建立了慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株，同时证实在TNF-诱导的炎症过程中GSTM5存在核转位，并与其N端含有非经典核定位信号密切相关。本研究发现为后续ALI炎症氧化失衡导致的肺结构细胞损伤调控机制的研究奠定基础。参考文献References: 1.Prabhakaran, P., Acute respiratory distress syndrome. 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