乙肝临床意义.ppt

时间分辨临床意义,乙肝“两对半”定量检测及临床应用,乙型肝炎的病因HBV,HBV颗粒，又称Dane颗粒，直径42nm 抵抗力:耐受566小时及一般消毒剂；10010分钟，或6510小时可灭活。37可保存7天，-20可保存15年,流行状况,在美国 100125万慢性患者 大部分新感染者为 20-39岁 大约 50% 有急性症状 大约 5,000 由于慢性肝炎死亡 在中国 HBsAg携带达10%（高发地区13%） 2800万乙肝患者 每年新发病人23/10万 感染率5080%,南方高于北方 全球3.5亿带菌者,几乎一半在中国,乙型肝炎的危害性,WHO估计 2000年全球慢性HBV感染达4000万 全球因乙肝死亡数100万/年 慢性HBV感染是引起肝硬化和肝细胞癌的最主要原因 肝癌(HCC)在HBV感染者的发病率是正常人群的1000倍(江苏启东,广西龙安) 3040%肝硬化病人的尸检是HCC,而90%HCC的发生在肝硬化的基础上 我国每年有数以万计的人死于肝硬化和HCC,传播途径,血液传播 药癖者感染 医院性传播 科室分布:消化,肝胆,普外和中医科(收容肝病多),口腔,化验,中心实验室,胃镜室,普外(接触机会多)感染机会高,血液,慢性肾衰病人(常需输血和透析),肿瘤病人,移植病人(免疫低下) 针刺感染:受伤者HBsAb10mIU/ml,容易感染,传染血液HBeAg(+),感染率6080% 肾透析传播:对病人和医护人员同样高危 母婴传播:垂直,围生和水平传播 日常生活和性传播,传播途径的有效阻断,输血传播:采用更灵敏的试剂筛查 母婴传播:主动/被动免疫,用更灵敏度的试剂筛查,用定量试剂评估和监测 针刺意外处理:用更灵敏度的试剂筛查,用定量试剂评估和监测 手术,血透和内窥镜检查病人的筛查:采用更灵敏的试剂筛查,乙型病毒性肝炎的诊断依据,流行病学资料 临床症状体征 实验室检查(常规生化和特异检查结果),HBV感染的确认,血清免疫学检测：HBV抗原抗体系统(乙肝两对半等） 分子生物学检测：HBV DNA的检测（PCR法定量，斑点杂交法技术等） 肝组织内HBV指标的检测,HBV血清指标,HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb HBc-IgM,乙肝表面抗原(HBsAg),第一个出现的血清指标 持续或6月为慢性感染 高浓度表示高复制,100ng/ml常同时伴HBeAg(+) 低浓度的HBsAg可能是: 在感染的恢复期,病毒低复制或不复制 组织病变高度活动时,病毒和抗原已被部分清除 可能是病毒变异 HBsAg(-)仍有可能HBV感染,排除检测试剂灵敏度问题,可能是血清中含量的差异,乙肝表面抗体(HBsAb),当失去 HBsAg后的恢复指标 疫苗注射后的免疫性评价指标 在HBV感染恢复期时: 多克隆抗体做试剂时,出现HBsAg和HBsAb都为阴性的所谓“窗口期” 单克隆抗体做试剂时,3%的病人出现HBsAg和HBsAb都为阳性 单一低浓度的HBsAb可能是假阳性(用一步反应夹心法的试剂) 单一单克隆抗体的使用会漏检(亚型或变异),乙肝核心抗体(HBcAb),表示现在或以前感染 与恢复或免疫无必然联系 由于HBcAg的高免疫原性,故HBcAb产生比HBsAb早且多,持续时间长(长达数十年) 在我国正常人群中有10%的单一HBcAb(+) 高浓度的HBcAb表示现行感染,常与HBsAg并存,主要是IgM,伴肝损伤,肝功能指标异常 低浓度的HBcAb表示过去感染,常与HBsAb共存,主要是IgG,无肝损伤或已静息 HBcAb含IgM,IgA和IgG,在感染中依此出现和消失,IgG长期存在,乙肝核心抗体IgM(HBcIgM),表示急性感染 发病一周出现占90%,也有1个月 持续时间2134周,14%超过1年 高滴度是诊断急性乙肝的“标准”(但需特殊标定) IgM(+),即使HBsAg(-),也可诊断急性肝炎 IgM(-),即使HBsAg(+),却可能是慢性HBV感染重叠其它病原的急性病变 暴发性乙型肝炎:可检出48倍的IgM浓度 慢性乙型肝炎:肝细胞破坏,释放HBcAg产生免疫应答,可检出低水平IgM 反应肝组织炎症:浓度与炎症程度相关 反应病毒复制和干扰素治疗的监控:对-干扰素有效治疗的慢性乙肝病人,在Hbe血清转换前常有IgM滴度升高,后降至治疗前水平,乙肝e抗原(HBeAg),病毒复制相关,常与HBV-DNA水平一致 于急性慢性感染中存在 缺乏的话, 不代表病毒复制不存在 在中国,30%的HBV感染者HBeAg(+),其中: 80%自然阴转 10%持续HBeAg(+) 10%应病毒变异而阴性 药物治疗的一个监测指标 多个国际著名药厂肝炎治疗药物的评价,如Glaxo的拉米呋定,施贵宝的恩替卡韦,Roche公司的干扰素等,包括全国唯一一家CAP认证的实验室-美迪生(MDS),使用雅培的肝炎试剂进行药物临床评估,乙肝e抗体(HBeAb),当与 HBeAg 消失出现表示病毒复制渐趋静息 HBe血清转换似为HBV感染过程的一个转折点 但在慢性活动性肝病HBeAb(+)未必表示病毒不复制 有些HBeAg消失后不出现HBeAb 当与 HBV-DNA 并存时可能表示前C区变异 只有一种IgG抗体 在HBV感染病人中,HBeAg和HBeAb同时阳性的有34%,乙肝血清指标一般简图,不一致或不常见的血清指标模式,HBsAg 阳性 AntiHBc阴性 HBsAg，Anti-HBs 和 AntiHBc阳性 单一AntiHBc阳性 HBsAg阴性，HBeAg阳性 HBeAg和Anti- Hbe同时阳性,单一HBsAg,急性HBV感染的早期,应随之出现HBeAg,HBc-IgM,如仍单独出现,需做确认 在慢行HBV感染中,HBsAg和HBcAb共存占95%,并常伴HBeAg或HBeAb,无HBe可出现在转换“窗期”,或感染恢复期HBeAb已消失, HBsAg不伴HBcAb很少见,一旦出现为HBcAb缺失,单一HBsAb,注射HB疫苗或高价乙肝免疫球蛋白(HBIG) 正常人群(非人工免疫)有510%的阳性率 如浓度较低,注意非特异性反应 一般为IgM抗体,无保护性,仍可再感染HBV,HBsAg和HBsAb并存,少数感染恢复期可出现,常规试剂可能是非特异性反应 在慢性HBV感染者中有35%二者共存,但并不表明HBsAg的清除或感染的恢复,可能是: 前后感染二种HBV亚型,或HBsAg与抗体间低亲和反应 S基因变异,HBsAg抗原性改变,原型HBsAb不能清除 IFN治疗出现HBsAb血清转换,因S基因变异,而未能清除HBsAg HB疫苗接种,有正常的HBsAb应答,HBsAg(-)而HBeAg(+),编码HBeAg的基因片段的短暂整合 Source: Lau JNY, et al. J Hepatol, 1993;17: 258,HBV感染,但HBcAb(-),抗原复合:高HBV复制,HBcAb被过量的HBcAg所掩蔽 种族差异:我国7个民族的HBV感染,HBcAb缺失3.440% 免疫缺陷: 缺乏HBcAg特异的T细胞,体外无淋巴细胞增殖反应,单核细胞不能吞噬HBcAg颗粒,可能是抗原提呈细胞的缺陷 HBsAg携带母亲出生的婴儿,由于母体的HBcAb的阻断,可无HBcAb的应答 在免疫缺陷病人中出现 肿瘤病人化疗所引起的免疫耐受 病毒变异:前C区缺失和其它变异,单一的HBcAb(+),小孩:HBsAg(+)的母亲由于胎盘的屏障不能传递HBsAg给胎儿,但HBcAb可通过,出生后将逐渐消失 成人: 感染后恢复:急性感染后“窗期”,主要是IgM抗体,随后出现HBsAb,但也可由于免疫应答较低未产生HBsAb,也可出现HBsAb后再消失 低水平感染状态:单一HBcAb(+)活动性慢性肝炎病人,60%可检出HBV-DNA(+),单一HBcAb(+)的“健康”人中,30%可检出病毒.这种无症状携带状态,可较长时间存在(注意数学后感染).相对浓度越高,HBV-DNA的检出率越高,低相对浓度常预示过去感染,不常见模式的问题解释,用新波试剂有部分病例不符常见模式原因: 试剂灵敏度提高 病毒变异,亚型 抗原复合物的形成 主动或被动免疫的表现 药物治疗的表现 种族差异 免疫缺陷或耐受 对于这些情况,建议继续跟踪,75-85%急性发病血清转换图,慢性乙肝携带者后期(小三阳),慢性乙肝携带者无血清学转变(大三阳),乙肝表面抗原“消失”变异,什么是 HBsAg 消失变异?,当感染乙肝病毒后，病毒在人体内复制 当病毒复制时，变异会自然发生。在某些条件下，会加速其发生 变异是改变了核酸序列，从而导致氨基酸序列的改变 对于选择性压力下，乙肝 HBsAg 变异可能会出现在疫苗和治疗中如: HBIG 治疗。野生型的HBV可能被中和，而变异株仍然存在，并具有活性,References: Oon, C.J. et al. 1995. Molecular epidemiology of Hepatitis B virus vaccine variants in Singapore. Vaccine 13: 699-702. Coleman, P.F. et al. 1999. Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants. Journal of Medical Virology 59: 19-24. Hunt, C.M. et al. 2000. Clinical Relevance of Hepatitis B Viral Mutations. Hepatology 31: 1037-1044.,HBsAg消失变异在哪些情况下经常发生,至少有以下三种情况: 1) 在HBsAg阴性个体中仍有HBV存在 2) 对于母亲HBsAg阳性，新生儿疫苗接种失败 3) 对于正位肝移植，免疫预防剂失败(OLT),Reference: Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: Potential Virological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297. orthotopic,哪些是最常发生的HBsAg 变异,通常于免疫区段称 “a” 决定簇,aa124-147 其中更容易变异的为接近于aa141145(此部位是抗体必需结合的部位)。最多的据报道是Gly-145-Arg 抗原,抗体是免疫反应的核心!,References: Coleman, P. F. et al. 1999. Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants. J. Med. Virol. 59: 19 - 24. Ijaz, S. et al. Novel Immunoassay for the Detection of Hepatitis B Surface Escape Mutants and Its Application in Liver Transplant Recipients. J. Med. Virol. 63: 210 - 216.,为什么HBsAg变异重要,Kalinina et al.第一个报道，HBV S 于暴肝中分离的变异导致严重的病毒分泌缺陷，此现象造成细胞迅速死亡，而肝衰竭。Gly 145 Arg 为其中的一个变异造成暴肝。,Kalinina, et al. 2001. A Dominant Hepatitis B Virus Population Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene Mutations from a Patient With Fulminant Hepatitis. Hepatology 34: 385 - 394.,为什么HBsAg变异重要,影响乙肝防疫(疫苗),流行(血站, 医院筛查)和诊断 假阴性结果将会产生不必要的复杂性或延误诊断.,漏检HBsAg部分后果,90% 感染HBV 的新生儿将成为慢性携带者。根据美国CDC的统计此人群中的死亡率为 15-25% (见CDC website ) 美国 CDC 估计美国 22,000 HBV阳性的母亲将产子。有变异情况的约 1.0-4.6%。所以在美国此人群中, 每年有220-1012 人发生变异,未经统计的其他人群的漏检,长期慢性乙肝病人的病毒突变 经历多种治疗方案的乙肝病人-治疗压力 病毒复杂共感染人群 免疫系统疾病的乙肝人群 其他(移植等),低水平HBsAg测定的重要性,国内低水平HBsAg病人的分布情况,正常人群中低水平的HBsAg(5ng/ml)为23% 在HBsAg(+)人群中占2324% 其中1ng/ml占45%左右(在低水平HBsAg样品中),提高检测灵敏度的重要性,中国肝炎人口多,基数大 造成确诊的困难 医院内的感染 输血传播 母婴传播的阻断,HBsAb定量在疫苗评估中的推荐,German Permanent Vaccination Commission(STIKO),国内疫苗评价标准,无应答者:无抗体产生(5%人群百分比) - 加强计量复种 低应答者:100mIU/ml (20%人群百分比) 无须复种,德国STIKO疫苗评价推荐,无应答者:无抗体产生 - 复种并随访Anti-HBs 低应答者:100mIU/ml 10年后复种,血清乙肝标志物（两对半）定性测定始于80年代中期，对乙肝的疾病诊断、病程监测、疗效观察起到了一定的作用。肝炎的恢复是一个动态过程，用阳性或阴性来判定结果会给临床带来许多困惑。随着临床医学的迅速发展，定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”，只能作程序式的、机械的判断，对某些结果不能作出合理解释，存在较大的缺陷，无法动态观察病情和疗效变化，为临床所能提供的信息有限。随着医学检验中新型标记方法的建立（时间分辨荧光免疫分析技术），使得 “两对半”定量测定成为可行，大大弥补了酶标（ELISA）定性检测的不足之处。,乙肝“两对半”检测历史,提高了检测的灵敏度,时间分辨荧光免疫技术（TRF）检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml，而酶标（ELISA）检测HbsAg灵敏度是1ng/ml，也就是说只有血清中的HbsAg达到1ng/ml酶标才会呈阳性。,急性乙肝早期诊断,急性乙肝早期：TRF定量能及早检出HbsAg，确证HBV感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间，而酶标在乙肝早期检测往往HbsAg呈阴性。 慢性乙肝：一些患者由于机体对HBV包膜蛋白(HbsAg)表达较低，酶标检测可出现HbsAg和抗-Hbs均阴性的情况，而TRF技术则可避免这些情况的出现，为正确判断病情提供依据,变异病毒的检测,病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而TRF定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出HbsAg和抗-Hbs。 血清中HbsAg含量和病人对HbsAg细胞免疫成反比关系，而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。定量HbsAg是反映这一关系的唯一手段。,一些群体如医护工作者、病人家属等，由于长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝，而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，可能呈低浓度感染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。,发现低浓度HbsAg携带者,以动态观察疗效和病情监测,疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的变化的过程，TRF定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据，指导治疗。,HbsAg和抗-Hbs的动态变化,定量分析HbsAg和抗-Hbs的浓度变化，可以预见急性乙肝是否处于恢复期。如HbsAg浓度降低，抗-Hbs的浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展。反之，HbsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而抗-Hbs一直处于较底水平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。,HbeAg和抗-Hbe的动态变化,定量分析HbeAg和抗-Hbe的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HbeAg向抗-Hbe转换的时期，即表现为HbeAg浓度（NCU）下降和抗-Hbe浓度（NCU）升高的过程。高浓度的HbeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的抗-Hbe一方面提示病情的好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。,抗-Hbc指标的变化,抗-Hbc浓度的高低可以反映病毒感染的状态。高浓度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。而低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。 有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈进行性变化。,一步法(固相载体,样品和标记物同时一起孵育,并在最后检测前只有一步冲洗)，这对较多干扰物质的疾病，如:肝炎，甲状腺激素和肿瘤标志物，容易产生干扰而使分析的灵敏度和特异性都受到影响 二步法(二个冲洗步骤，一次在固相载体和样品孵育之后，第二次在加入标记物孵育之后)可以确保好的结果。如：消除非特异性蛋白结合，内源性的干扰物质和HOOK效应,关于一步法和二步法,两步冲洗法-可避免此效应,高浓度样品,高浓度的结合物,前带/后带效应的机制,固相载体,一步法 和 两步法 比较,一步法 优点： 相同的其他因素时，一步法可增加灵敏度 可降低成本，包括：劳动力和时间，自动化仪器 缺点： 夹心法有HOOK效应(10000ng/ml) 非特异性反应 其他样本质素的干扰,两步法 优点： 特异性较好 无HOOK效应 结果稳定，精密度较好 仍具有相当的灵敏度（其 它因素有提高空间） 缺点： 成本相对略高 一般操作时间延长,HbeAg阳性慢性肝炎，由于HBV野生型感染引起，其自然史分HbeAg阳性期和抗-Hbe阳性期。定量测定能明确检测HbeAg向抗-Hbe转化的时期，即表现为